徐騰月 任 霞

中國(guó)人民解放軍食品檢測(cè)試驗(yàn)中心 北京 101301

沙門(mén)菌是最常見(jiàn)的食源性細(xì)菌病原體，是食物傳播病原菌中研究最多的一種病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國(guó)各類(lèi)細(xì)菌性的食物中毒中，沙門(mén)菌常常位居前列。所以，沙門(mén)菌的檢測(cè)是各個(gè)國(guó)家檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)食品的必檢項(xiàng)目之一。

檢測(cè)食源細(xì)菌的傳統(tǒng)方法是對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離和生化鑒定，有時(shí)還需要進(jìn)行血清學(xué)鑒定，繁瑣耗時(shí)。因此快速、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)微生物的新技術(shù)、新方法不斷出現(xiàn)，可提高食品微生物檢驗(yàn)工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。

通過(guò)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，能夠發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題，幫助實(shí)驗(yàn)室不斷改善技術(shù)和管理水平，同時(shí)還能增加客戶(hù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的信任程度[1]。

為了提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力和水平，本實(shí)驗(yàn)室參加了由原遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局組織的沙門(mén)菌檢測(cè)能力驗(yàn)證。此次能力驗(yàn)證樣品2個(gè)、標(biāo)準(zhǔn)菌株1個(gè)、樣品4個(gè)、樣品加標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌懸液2個(gè)，共9個(gè)樣品采用國(guó)標(biāo)GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法》[2]和3M測(cè)試片法，2種方法對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，取得滿(mǎn)意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

沙門(mén)菌樣品（凍干粉），由原遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局提供；鼠傷寒沙門(mén)菌 （ATCC 14028）3M測(cè)試片，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；4種口味的壓縮干糧，由軍代室提供。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂、沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基、沙門(mén)菌干制生化鑒定試劑盒，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

沙門(mén)菌屬O多價(jià)血清A-F，購(gòu)于寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；AV8101精密天平（美國(guó)Spiral Biotech公司）；400VW均質(zhì)器（法國(guó)Interscience公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）。

2 樣品制備

2.1 樣品原液的制備

無(wú)菌開(kāi)啟西林瓶，立即加入少量（2～4 mL）稀釋液（生理鹽水）進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述的無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液，全過(guò)程20 min內(nèi)完成[3]。

2.2 菌懸液的制備

以無(wú)菌生理鹽水將鼠傷寒沙門(mén)菌制成菌懸液，于 36℃±1℃，18～24 h增菌培養(yǎng)后備用。

3 檢驗(yàn)方法及結(jié)果

采用GB4789.4-2016和3M測(cè)試片2種方法進(jìn)行檢測(cè)。其中3M測(cè)試片只做前增菌的步驟。同時(shí)2種方法均利用標(biāo)準(zhǔn)菌株作對(duì)照。

3.1 預(yù)增菌

（1）以無(wú)菌操作吸取水化后的樣品原液25 mL，加入裝有225mL滅菌BPW的無(wú)菌錐形瓶，震蕩搖勻。

（2）固體樣品粉碎后稱(chēng)取25 g，加入滅菌225 mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器拍打1～2 min。

（3）20 g粉碎固體樣品和5mL菌懸液后加入滅菌225 mL BPW的無(wú)菌錐形瓶，用均質(zhì)器拍打1～2 min。 于 36℃±1℃，培養(yǎng) 8～18 h。

3.2 增菌

取預(yù)增菌后的BPW 緩沖液中分別移取1 mL轉(zhuǎn)接種于 10 mL TTB內(nèi)，于 42℃±1℃培養(yǎng) 18～24 h；移取1 mL轉(zhuǎn)接種于10 mL SC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。

用無(wú)菌吸管吸取1mL能力驗(yàn)證樣品、樣液和樣品加菌懸液的勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10 s左右；同時(shí)做菌株的勻液。 于 36℃±1℃，培養(yǎng) 15～24h。

結(jié)果：沙門(mén)菌在3M測(cè)試片上的結(jié)果應(yīng)為綠色菌落。

（1）菌株在3M測(cè)試片上的結(jié)果為綠色菌落。

（2）能力驗(yàn)證樣品1在3M測(cè)試片上的結(jié)果為黃色菌落。

（3）能力驗(yàn)證樣品2在3M測(cè)試片上的結(jié)果為綠色菌落。

（4）樣品1在3M測(cè)試片上的結(jié)果為黃色菌落。

（5）樣品2在3M測(cè)試片上的結(jié)果為黃色菌落。

（6）樣品3在3M測(cè)試片上的結(jié)果為黃色菌落。

（7）樣品4在3M測(cè)試片上的結(jié)果為黃色菌落。

（8）樣品加菌懸液1在3M測(cè)試片上的結(jié)果為綠色菌落。

（9）樣品加菌懸液2在3M測(cè)試片上的結(jié)果為綠色菌落。

3.3 分離

取增菌后的沙門(mén)菌增菌液分別接種在沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板于36℃±1℃，培養(yǎng)18～24 h。BS瓊脂平板上，于 36℃±1℃，培養(yǎng) 40～48 h。觀(guān)察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)，詳見(jiàn)表1。

表1 在不同選擇性瓊脂平板上的菌落結(jié)果

通過(guò)觀(guān)察可以確定沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基生長(zhǎng)的白色和藍(lán)綠色菌落、BS瓊脂平板上白色的菌落為非典型菌落，不符合標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)可以排除。沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上的紫色菌落為A菌，XLD瓊脂平板上的能力驗(yàn)證樣品1上和樣品1～4上為黃色菌落為B菌，黑色菌為C菌，能力驗(yàn)證樣品2上的菌落形態(tài)是黑色有光澤和黃色為D和E菌，BS瓊脂上灰黑色無(wú)光澤為F菌，灰綠色帶有黑心為G菌，黑色有金屬光澤為H菌。一共8種菌落為可疑菌，需進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定。

3.4 生化鑒定套裝試驗(yàn)結(jié)果

（1）分別從沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A到H共8種菌落及標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種在三糖鐵瓊脂和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基上，于 36℃±1℃，培養(yǎng) 18～24 h，觀(guān)察結(jié)果，詳見(jiàn)表2。

表2 沙門(mén)菌屬在三糖鐵瓊脂和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果

通過(guò)在三糖鐵瓊脂和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基生化試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的B、C、F 3種菌落生化反應(yīng)均不符合沙門(mén)菌的生化特征，標(biāo)準(zhǔn)菌株符合沙門(mén)菌的生化特性。

（2）生化鑒定套裝試驗(yàn)：分別從沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A、D、E、G、H共5種分別接種到沙門(mén)菌干制生化鑒定試劑套裝中的試劑中，于 36℃±1℃，培養(yǎng) 18～24 h，觀(guān)察結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 生化鑒定結(jié)果

通過(guò)生化試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的A、D、E、G、H 5種菌落生化反應(yīng)均符合沙門(mén)菌的生化特征，標(biāo)準(zhǔn)菌株符合沙門(mén)菌的生化特性。

3.5 血清學(xué)鑒定

先檢查待測(cè)菌有無(wú)自凝現(xiàn)象。經(jīng)檢查兩種可疑菌均未發(fā)生自凝的現(xiàn)象。

在玻片上劃出2個(gè)約1 cm×2 cm的區(qū)域，挑取一環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在右邊區(qū)域加1滴沙門(mén)菌屬O多價(jià)血清A-F，在左邊區(qū)域加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無(wú)菌的接種環(huán)將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液[2]。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，并對(duì)著黑色背景進(jìn)行觀(guān)察，可疑菌A、D、E、G、H均發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，B、C、F可疑菌均未發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陰性。標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。

4 結(jié)論

利用2種方法檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品1均未檢出沙門(mén)菌，能力樣品2均檢出沙門(mén)菌，結(jié)果為滿(mǎn)意。樣品1～4未檢出沙門(mén)菌、菌懸液加樣品1和樣品2有效的檢出沙門(mén)菌。

3M測(cè)試片的方法無(wú)需特定的儀器設(shè)備，且操作簡(jiǎn)單、快速出結(jié)果、靈敏度高、易于判斷；該方法已獲得AOAC官方方法認(rèn)證，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合應(yīng)用于廣大食品企業(yè)和政府實(shí)驗(yàn)室沙門(mén)菌的檢測(cè)[4]。

國(guó)標(biāo)法是經(jīng)典的檢測(cè)方法，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜[5]。3M 測(cè)試片方法檢測(cè)能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出結(jié)果。2種方法結(jié)合，綜合判斷，可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過(guò)這次能力驗(yàn)證，提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，積累經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了很多不足：

（1）3M測(cè)試片法中由于實(shí)驗(yàn)室很少做，因?yàn)椴恢芰︱?yàn)證樣品中添加的沙門(mén)菌的濃度，直接使用前增菌液，導(dǎo)致測(cè)試片上沒(méi)有單個(gè)菌落生長(zhǎng)，最好使用增菌后的的液體。或者使用3M測(cè)試片法測(cè)定沙門(mén)菌配套的試劑。

（2）沙門(mén)菌分離純化可疑菌的時(shí)候，需要多次純化，本次實(shí)驗(yàn)只挑取了選擇瓊脂上的可疑菌落，以后實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)可疑菌的時(shí)候應(yīng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化后再進(jìn)行生化試驗(yàn)。

（3）血清學(xué)鑒定的時(shí)候兩種診斷血清都應(yīng)該做，然而實(shí)驗(yàn)室只做了沙門(mén)菌屬O多價(jià)的，盲樣未凝集故實(shí)驗(yàn)室沒(méi)做抗原H的鑒定，在以后的試驗(yàn)過(guò)程中如果O多價(jià)凝集后必須再做抗原H的鑒定。