■ 劉媛媛 馮秋月 張旭強 李 康 王安如 曹廷鋒 閆 雪*

（1.北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100192；2.北京市飼料安全生物調(diào)控工程技術(shù)研究中心，北京 100192；3.山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司，山東臨沂 276016）

殼寡糖（β-1,4-寡糖-葡萄糖胺）又叫殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是殼聚糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)降解得到的一種聚合度在2～20之間寡糖產(chǎn)品，分子量≤3 200 Da，是水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量產(chǎn)品。近年來，殼寡糖的諸多生理活性已被廣泛研究，殼寡糖分子帶有活性氨基基團，而且可被動物直接吸收釋放到血液中并作用于靶細胞，在提高機體抗氧化能力方面發(fā)揮著重要作用[1]，殼寡糖可被巨噬細胞內(nèi)吞[2]，刺激巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子和活性氮氧化物[3]。殼寡糖的許多性質(zhì)，例如聚合度、脫乙酰化度、電荷分布以及對分子的化學修飾都會強烈影響到其表觀生物活性[4]，因而殼寡糖也越來越多被應用于飼料當中，并表現(xiàn)出抑菌性、抗氧化和清除體內(nèi)自由基等不同的生理活性[5-13]，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。仔豬在斷奶時會出現(xiàn)不同程度的生長障礙，例如仔豬被毛粗亂、不吃料、消瘦甚至出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象，但目前殼寡糖在雞上（包括肉仔雞和蛋雞）的應用研究相對比較深入[14-22]，在仔豬上應用報道很少，同時由于殼寡糖產(chǎn)品的不均一性，其聚合度和脫乙酰度影響了殼寡糖產(chǎn)品功能的多樣性，因此本試驗考察了殼寡糖不同添加量對斷奶仔豬生長性能、血清抗氧化指標及腸道微生物菌群的影響，旨在改善仔豬在斷奶時的應激，也為殼寡糖在仔豬的應用研究上提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

殼寡糖：聚合度2～10，相對分子質(zhì)量≤2 000 Da，純度為80%，脫乙酰度為90%，由山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 試驗動物及日糧

試驗動物選用“杜×長×大”三元雜交豬，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平參考范彧等[23]。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗在唐山大北農(nóng)豬育種科技有限責任公司動物試驗場進行，選取300頭(6.71±0.19)kg“杜×長×大”健康的28日齡斷奶仔豬，根據(jù)“胎次一致、品種相同、體重相近、公母各半”的原則隨機分成5個處理，每個處理6個重復，每個重復10頭豬。其中A組為對照組，飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，試驗組（B、C、D、E）在基礎(chǔ)日糧中分別添加不同劑量的殼寡糖，添加水平見表1。仔豬自由采食和飲水，試驗進行35 d。

1.4 樣品采集與檢測

1.4.1 生產(chǎn)性能的測定

試驗開始、第14 d和第35 d結(jié)束時對豬進行空腹稱重，試驗期間每天記錄采食量，計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。同時統(tǒng)計腹瀉率。

表1 不同劑量殼寡糖試驗分組

1.4.2 血清抗氧化指標測定

試驗第14 d和第35 d，空腹前腔靜脈采集血液，分離制備血清，保存于-80°C冰箱中待測。血清中總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及丙二醛（MDA）含量的檢測采用試劑盒方法，試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4.3 糞便微生物的測定

斷奶后試驗開始前，第0 d、第14 d和第35 d采集仔豬糞便。與當天飼喂前用干凈竹簽從自然排出的糞便深處采集樣品。稱取0.2 g糞便樣品，采用天根糞便基因組DNA提取試劑盒要求提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）與16S rDNA測序分析微生物組成結(jié)構(gòu)，參照曾燕等[24]方法進行樣品細菌的PCR-DGGE。回收DGGE圖譜上的共性條帶和特異性條帶，進行克隆測序。DGGE凝膠圖采用Quantity One(Bio-Rad)凝膠定量軟件進行圖譜分析。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并進行聚類分析和相似性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SAS 8.0程序GLM過程進行統(tǒng)計分析，多重比較采用鄧肯氏法（Duncan's），以P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.10為討論趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量殼寡糖對斷奶仔豬生長性能的影響(見表2)

由表2可知，與對照組（A組）相比，C組和E組提高了斷奶仔豬15～35 d和0～35 d這兩個階段的平均日增重，并且降低了料重比（P＜0.05）；而B組則明顯使這兩個階段的平均日增重降低，顯著提高了料重比（P＜0.05）；但是各試驗組對0～14 d階段的平均日增重、采食量以及料重比沒有顯著影響（P＞0.05）。B組和C組有效降低了斷奶仔豬的腹瀉率，D組和E組則提高了斷奶仔豬的腹瀉率。

表2 不同劑量的殼寡糖對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 不同劑量的殼寡糖對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響(見表3)

由表3可知，與對照組（A組）相比，在0～14 d階段C組有提高血清中總抗氧化能力（T-AOC）的微弱趨勢，其它試驗組則呈現(xiàn)少許降低血清中總抗氧化能力（T-AOC）的趨勢；C組和D組顯著提高0～14 d階段血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量（P＜0.05），B組和E組也有一定程度提高。0～35 d階段，只有C組顯著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量，其它試驗組對所檢測的抗氧化指標并無影響。

表3 不同劑量的殼寡糖對斷奶仔豬血清中抗氧化相關(guān)指標的影響

2.3 不同劑量的殼寡糖對斷奶仔豬糞便微生物多樣性的影響

2.3.1 仔豬斷奶后飼喂不同劑量殼寡糖14 d的糞便DGGE檢測結(jié)果（見圖1）

樣品經(jīng)16S rDNA V3區(qū)PCR擴增后進行DGGE分離。在PCR-DGGE圖譜(圖1)中，條帶亮度與該菌株含量成正比，深色條帶為該樣本中的優(yōu)勢菌。通過圖譜聚類分析及樣品相似度結(jié)果（見圖1、圖2、圖3）顯示A組、B組、C組和E組聚類明顯，由于動物個體差異較大造成聚類不明顯，其他組沒有明顯聚類現(xiàn)象。通過標記條帶測序結(jié)果分析可見：斷奶后試驗開始前的對照組中，1號Uncultured bacterium（不可培養(yǎng)細菌）數(shù)量相較于其它處理組數(shù)量較多，而2號Uncultured bacterium（不可培養(yǎng)細菌）數(shù)量較少；B組、C組、D組以及E組中，3號Uncultured bacterium（不可培養(yǎng)細菌）數(shù)量較多，并且4號Prevotella marshii（普氏菌屬）的數(shù)量相較于試驗開始前的對照組較高（見圖1、表4）。

2.3.2 仔豬斷奶后飼喂不同劑量殼寡糖35 d的糞便DGGE檢測結(jié)果

通過圖譜聚類分析及樣品相似度結(jié)果（見圖4、圖5、圖6）顯示E組聚類明顯，其他組沒有明顯聚類現(xiàn)象。通過標記條帶測序結(jié)果分析可見：仔豬斷奶后試驗開始之前的對照組中，1號Uncultured bacterium（不可培養(yǎng)細菌）、2號Uncultured bacterium（不可培養(yǎng)細菌）以及3號Gemmiger formicilis（吉米菌屬）數(shù)量較多；飼喂殼寡糖35 d的B組及C組仔豬糞便中，4號Prevotella copri（普氏菌屬）數(shù)量相對較高；C組中，5號Papillibacter cinnamivorans數(shù)量相較于其它各處理組較高；而D組中，6號Clostridium aurantibutyricum（金黃丁酸梭菌）數(shù)量相對較高（見圖4、表5）。

3 討論

圖1 試驗第14 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

圖2 試驗第14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類分析結(jié)果

圖3 試驗第14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結(jié)果

表4 試驗第14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜中標記條帶測序結(jié)果

本試驗證明添加適量殼寡糖可有效降低斷奶仔豬的腹瀉率，對0～14 d的平均日增重、采食量以及料重比沒有顯著影響，但可提高血清中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶（SOD）含量；降低了15～35 d和0～35 d這兩個階段的料重比，對此階段的抗氧化指標并無顯著影響，飼喂殼寡糖14 d，各組糞便的微生物組成差異并不明顯。飼喂殼寡糖35 d，添加殼寡糖使糞便中能產(chǎn)生甲酸、丁酸、乙酸的Gemmiger formicilis[25-26]（甲酸芽殖菌）數(shù)量減少；B、C組引起腸道炎癥Prevotella copri[27]（普氏菌屬）的數(shù)量增加；但是C組糞便中可將肉桂酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸Papillibacter cinnamivorans[28]的有益菌增多；D組糞便中有益菌Clostridium aurantibutyricum[29]（金黃丁酸梭菌）增多，該菌可水解淀粉和糖類的最終代謝產(chǎn)物為丁酸、醋酸和乳酸。因此，殼寡糖的添加在有效抑制有害菌生長方面效果并不明顯，且?guī)缀跷从绊憯嗄套胸i糞便微生物組成結(jié)構(gòu)與多樣性。

圖4 試驗第35 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

圖5 試驗第35 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類分析結(jié)果

圖6 試驗第35 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結(jié)果

表5 試驗第35 d各組仔豬糞便DGGE圖譜中標記條帶測序結(jié)果

殼寡糖階段性作用比較明顯，這與他人研究一致，黨國旗等[10]探討殼寡糖對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用率及健康狀態(tài)的影響發(fā)現(xiàn)，日糧中添加100、150 g/t殼寡糖可顯著提高日增重7.93%、14.02%；顯著降低料重比11.02%、12.27%；腹瀉率分別下降40.04%、54.78%；王秀武等[11]研究表明日糧中添加200 mg/kg殼寡糖可顯著提高35日齡和70日齡仔豬體重；張玲等[12]也研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加殼寡糖可極顯著緩解應激仔豬日增重的降低、極顯著改善飼料轉(zhuǎn)化率；龍次民等[13]則將殼寡糖實驗應用于妊娠85 d的母豬上，結(jié)果殼寡糖可提高新生仔豬體內(nèi)抗氧化酶活性及其上游調(diào)控基因的表達，提高仔豬抗氧化力。但由于市場上殼寡糖聚合度和脫乙酰度等的不同，生理活性會產(chǎn)生不同的影響，加之殼寡糖在斷奶仔豬的應用上還未深入，因此應系統(tǒng)加深相同聚合度或者相同脫乙酰度的殼寡糖的研究，規(guī)范殼寡糖使用添加，本試驗中高劑量的殼寡糖有提高斷奶仔豬腹瀉率的趨勢。殼寡糖在肉仔雞、蛋雞上的作用效果顯著，王秀武等[14]研究發(fā)現(xiàn)日糧添加0.1%殼寡糖可顯著提高肉仔雞增重(P＜0.05)，8周齡體重比對照組提高18%，料重比較對照組降低3.4%，同時[15]還以1日齡肉仔雞作為試驗對象，隨殼寡糖添加劑量增加各周齡平均體重增加，7周齡出欄時殼寡糖組（125 g/t）平均體重增加140 g，提高5.85%，料重比降低3.93%；孟曉[16]選用58周齡蛋雞進行試驗，結(jié)果表明蛋雞日糧中添加不同水平的殼寡糖（分子量1 kDa）對蛋雞的料蛋比、平均日采食量和平均蛋重均無顯著性差異，添加300 mg/kg殼寡糖顯著提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率；閆冰雪[17]選用1日齡白羽雞進行相關(guān)研究，結(jié)果表明基礎(chǔ)日糧中添加300 mg/kg殼寡糖顯著提高了1～42 d體增重及前期（1～21 d）和全期（1～42 d）的耗料量，分別比對照組提高了15.929%（P＜0.05）和 13.819%（P＜0.05）、14.191%（P＜0.05）；殼寡糖階段性效果顯著，與本試驗結(jié)果相同。日糧中添加適宜劑量殼寡糖可提高仔豬生長性能，改善飼料轉(zhuǎn)化率，并提高仔豬健康水平。

4 結(jié)論

在對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響上，C組和E組效果較好，提高了飼料轉(zhuǎn)化率大約為4%～5%左右，且添加時間在15～35 d階段效果顯著。B組降低斷奶仔豬腹瀉率高達28%，C組降低腹瀉率60%。試驗14 d，C組對提高血清中總抗氧化能力（T-AOC）上稍有作用，C組和D組大大提高血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量；試驗35 d，C組顯著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。飼喂殼寡糖35 d，添加殼寡糖使糞便中能產(chǎn)生甲酸、丁酸、乙酸的Gemmiger formicilis（甲酸芽殖菌）數(shù)量減少；C組糞便中可將肉桂酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸Papillibacter cinnamivorans的有益菌增多；D組糞便中有益菌Clostridium aurantibutyricum（金黃丁酸梭菌）增多。

綜合以上分析結(jié)果，殼寡糖添加量在0.5 g/kg飼料時，可以有效提高斷奶仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率和降低腹瀉率，并提高血清中抗氧化酶活性。且殼寡糖在添加前期主要體現(xiàn)在抗氧化作用方面，添加后期主要體現(xiàn)在提高生產(chǎn)性能方面。