■景宇超 馬豐英 楊 倩 蔣貽海*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京210095；2.青島蔚藍生物股份有限公司國家動物用保健品工程技術研究中心，山東青島266111）

由于抗菌藥的不合理使用，加大了畜禽產(chǎn)品中藥物殘留，耐藥菌株也隨之增加。抗菌藥不僅對有害菌具有滅殺作用，其對腸道內的正常微生物群也有抑制和殺滅作用，長期使用會導致胃腸道正常菌群失調，引起動物內源性感染或二重性感染[1]。長此以往，將嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)持續(xù)發(fā)展，對人類食品安全和抗菌藥資源利用是一種巨大威脅。因此，微生態(tài)制劑應運而生，微生態(tài)制劑是指利用活的腸道益生菌或其菌體成分及代謝產(chǎn)物或能促進腸道微生物生長繁殖的物質制成的制劑[2]。能夠調節(jié)和維持動物腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌的生長、提高機體代謝以及飼料吸收率，有助于畜禽生長，而且無毒、無耐藥性，是抗菌藥的理想替代品[3-4]。

乳酸菌是一種應用已久的益生菌，種類有200多種，其中一些乳酸菌也是腸道微生物的固有益生菌群[5-6]，乳酸菌具有多種生物學作用，包括促進腸道對營養(yǎng)物質的吸收，增強抵抗力，抑制外源有害菌等[7]。屎腸球菌屬于乳酸菌，是腸球菌屬，革蘭陽性菌[8]，需氧或兼性厭氧；是動物腸道正常菌種之一，在腸道微生物群中維持一定比例，與其他腸道益生菌相互協(xié)作共同維持宿主的正常生理功能[9]。屎腸球菌是我國農(nóng)業(yè)部公布的飼料添加劑目錄中允許使用的微生物菌種。據(jù)報道益生腸球菌在體內發(fā)酵可產(chǎn)生大量乙酸和乳酸，使腸道內容物的pH值下降，從而拮抗病源性細菌的生長繁殖；同時可以產(chǎn)生細菌素，對食物中的腐敗微生物或有害病原菌起到殺滅作用。因此，屎腸球菌在微生態(tài)制劑方面具有廣闊的應用前景[10]。

目前對乳酸菌屬的菌種均采用MRS培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)[11]，為實現(xiàn)屎腸球菌的工業(yè)化生產(chǎn)，提高其發(fā)酵活菌量，本文對屎腸球菌CCTCCM2017191在MRS培養(yǎng)基的基礎上進行了培養(yǎng)基優(yōu)化，利用單因素試驗，Plackett-Burman試驗，最陡爬坡試驗以及中心復合序貫試驗與響應面分析法成功優(yōu)化了屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，實現(xiàn)了屎腸球菌CCTCCM2017191的高密度發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

青島蔚藍生物股份有限公司國家動物用保健品工程技術研究中心分離得到的屎腸球菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號為CCTCC NO:M2017191。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）；牛肉浸粉、瓊脂糖（青島高科園海博生物技術有限公司）；K2HPO4·3H2O、檸檬酸氫二銨、硝酸鈉、硫酸銨（國藥集團化學試劑有限公司）；麥芽糊精、魚蛋白胨、低聚異麥芽糖、玉米漿干粉（上海瑞永生物科技有限公司）；結晶乙酸鈉、MgSO4、MnSO4·H2O、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉（天津市巴斯夫化工有限公司）；吐溫-80（天津市瑞金特化學品有限公司）；氯化鈉、氯化氫、氫氧化鈉（天津市北辰方正試劑廠）。

1.1.3 試驗儀器與設備

超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）、恒溫搖床（上海福瑪實驗設備有限公司）、電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）、WGZ-2XJ細菌濁度計（上海昕瑞儀器儀表有限公司）、pH計（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.1.4 基礎培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g/l、結晶乙酸鈉5.0 g/l、MgSO40.2 g/l、MnSO4·H2O 0.04 g/l、檸檬酸二胺 2.0 g/l、葡萄糖20.0 g/l、酵母浸粉4.0 g/l、牛肉浸粉8.0 g/l、胰蛋白胨10.0 g/l、吐溫-80 1.0 g/l，121 ℃滅菌15 min。MRS固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎上添加瓊脂糖14 g/l，121℃滅菌15 min，冷卻至不燙手即可傾倒平皿。

1.2 試驗方法

1.2.1 屎腸球菌菌種活化

將屎腸球菌的保藏菌液于MRS平板培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；挑取平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，最后再用此菌液在MRS平板培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，培養(yǎng)新的單菌落待用。

1.2.2 屎腸球菌生長曲線的測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，然后將其以1%(v/v)的接種量接種到三瓶盛有150 ml MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶（30%裝液量），于恒溫搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)，每間隔1 h用濁度儀測定錐形瓶中菌液濁度。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 屎腸球菌最適生長pH值的測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，然后將其以1%(v/v)的接種量接種到30%裝液量的不同pH值（pH值=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的MRS培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)，12 h后測定不同pH值培養(yǎng)基條件下菌液濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.2 屎腸球菌的最適生長溫度測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h。將配置的MRS培養(yǎng)基調節(jié)到最適pH值，然后將屎腸球菌以1%(v/v)的接種量接種到30%裝液量最適pH值的MRS培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度（T=33、35、36、37、38、39、41 ℃）的恒溫搖床中120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同溫度下培養(yǎng)基中屎腸球菌的濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.3 最適碳源選擇

使用不同碳源代替MRS培養(yǎng)基中的碳源進行單因素試驗，以篩選最適合該屎腸球菌生長的碳源。所選碳源包括：果糖20 g/l、蔗糖19.5 g/l、乳糖19.5 g/l、麥芽糖19.5 g/l、低聚異麥芽糖20 g/l、麥芽糊精20 g/l、可溶性淀粉20 g/l，不同碳源的添加量是按照與MRS培養(yǎng)基中葡萄糖的含碳量一致的原則換算添加，另設MRS培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)基調節(jié)至最適pH值，于最適溫度下120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同碳源培養(yǎng)基中屎腸球菌的菌液濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.4 最適氮源選擇

將MRS培養(yǎng)基中的碳源換為最適碳源，使用不同氮源代替MRS中的復合氮源（蛋白胨10 g/l、牛肉浸粉8 g/l、酵母粉4 g/l）進行單因素試驗，以篩選最適合該屎腸球菌生長的氮源。篩選的氮源包括：蛋白胨19.18 g/l、牛肉浸粉 21.58 g/l、玉米漿干粉 57.5 g/l、魚蛋白胨18.5 g/l、酵母浸粉37.0 g/l、硝酸鈉15.69 g/l、硫酸銨12.21 g/l，各氮源的添加量是按照MRS培養(yǎng)基中復合氮源的含碳量添加的，另設復合氮源作為對照組。培養(yǎng)基調節(jié)至最適pH值，于最適溫度下120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同氮源培養(yǎng)基對屎腸球菌的菌液濁度和活菌數(shù)的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設計

根據(jù)單因素試驗篩選出該屎腸球菌的最適碳源和氮源后，選取最佳碳源、最佳氮源、檸檬酸氫二銨、結晶乙酸鈉、檸檬酸氫二鉀、無水硫酸鎂、吐溫-80和硫酸錳共8個因子進行Plackett-Burman試驗，以篩選影響屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的顯著影響因子。

1.2.5 最陡爬坡試驗

據(jù)Plackett-Burman試驗的結果，選取具有顯著影響效應的因子，根據(jù)顯著影響因子的估計系數(shù)、正負效應，以及實際情況設計爬坡試驗的方向和步長，設置不同梯度進行試驗，以確定顯著影響因子具有最大活菌數(shù)的濃度范圍。

1.2.6 中心復合序貫設計與響應面分析

以Plackett-Burman試驗所篩選的顯著影響因子濃度作為自變量，菌液活菌數(shù)為響應值，最陡爬坡試驗結果中具有最大活菌數(shù)的濃度梯度作為響應面設計的中心點，采用中心序貫設計法設計3因素3水平試驗，運用響應面分析法得到各顯著影響因子的最佳濃度。

1.2.7 優(yōu)化配方檢驗

為了檢驗優(yōu)化培養(yǎng)基的實際效果，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基在相同條件下進行搖瓶發(fā)酵試驗，統(tǒng)計試驗結果，以驗證回歸模型是否可靠，屎腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是否成功。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗結果的數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”的形式表示，利用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)，P＜0.05和P＜0.01認為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上差異顯著。Plackett-Burman試驗、中心復合序貫試驗的設計、數(shù)據(jù)分析、模型建立以及響應面分析均采用Minitab 16軟件完成。試驗作圖采用Origin 9.0完成。

2 結果

2.1 屎腸球菌的生長曲線

根據(jù)所測菌液濁度繪制屎腸球菌CCTCCM2017191的生長曲線（見圖1）?？梢钥闯?～4 h屎腸球菌的菌液濃度沒有很大的改變，這是其進入新環(huán)境的適應準備階段，是屎腸球菌的遲緩期；4～12 h屎腸球菌的菌液濃度快速上升至頂峰，表明這是屎腸球菌生長繁殖最快的一個時期，此期為其對數(shù)生長期；12 h之后屎腸球菌進入生長穩(wěn)定期，菌液濃度比較穩(wěn)定，沒有很大的變化。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 最適生長pH值的測定

根據(jù)屎腸球菌在不同pH值培養(yǎng)基中的生長狀況（見圖2）可知，培養(yǎng)基的pH值為8.0時屎腸球菌CCTCCM2017191具有最高的菌液濁度（P＜0.01），菌液活菌數(shù)也達到最高水平（P＜0.01），因此，確定該屎腸球菌生長的最適pH值為8.0。

圖1 屎腸球菌的生長曲線

圖2 pH值對屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響

2.2.2 最適生長溫度的測定

圖3 溫度對屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響

由圖3所示，屎腸球菌在37℃的條件下培養(yǎng)具有最高的菌液濁度（P＜0.01），并且活菌量（P＜0.01）可達最高，因此，確定該屎腸球菌的最適生長溫度為37℃。

2.2.3 最適碳源的選擇

屎腸球菌在不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后測定菌液濁度以及活菌量，由圖4可知，麥芽糊精對屎腸球菌CCTCCM2017191具有最好的培養(yǎng)效果，菌液濁度（P＜0.05）和活菌量（P＜0.01）都達到最高，因此，確定該屎腸球菌最適生長碳源為麥芽糊精。

圖4 最佳碳源篩選

2.2.4 最適氮源的選擇

不同氮源培養(yǎng)條件下屎腸球菌發(fā)酵量的差異比較大，由圖5所示，無機氮源的活菌量最低，有機氮源中酵母浸粉的菌液濁度(P＜0.05)顯著高于其他氮源，并且活菌量（P＜0.01）極顯著高于其他氮源，因此，確定該屎腸球菌的最適生長氮源為酵母浸粉。

圖5 最佳氮源篩選

2.3 Plackett-Burman試驗設計結果

根據(jù)以上單因素試驗結果，將篩選到的最佳碳源麥芽糊精和最佳氮源酵母浸粉代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖和復合氮源作為優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，并將麥芽糊精、酵母浸粉、結晶乙酸鈉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80共8個因子作為Plackett-Burman試驗設計的基本因素，另設3個虛擬變量以估計試驗誤差，各因子取高低兩個水平（見表1）進行試驗并統(tǒng)計試驗結果（見表2）。

表1 Plackett-Burman試驗設計因子水平

對試驗結果進行統(tǒng)計分析，可得各因子的效應及其顯著性（見表3），可知正效應因子酵母浸粉（P＜0.01）和結晶乙酸鈉（P＜0.05），負效應因子吐溫-80（P＜0.05）在統(tǒng)計學上差異顯著，具有顯著影響效應，其余因子（P＞0.05）差異不顯著，因此將這三個因子作為中心復合序貫試驗的基本因素。

2.4 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選結果，選取酵母浸粉、結晶乙酸鈉、吐溫-80為三個顯著因子進行最陡爬坡試驗以獲取其在活菌數(shù)最高時的濃度區(qū)域。根據(jù)各因子的系數(shù)以及實際應用情況確定步長并設置七個梯度進行試驗，由試驗結果(見表4)可知，試驗4所對應梯度的活菌數(shù)最高，所以選取酵母浸粉65.5 g/l、結晶乙酸鈉6.75 g/l、吐溫-80 1 g/l作為中心復合序貫試驗的中心點。

表2 Plackett-Burman試驗設計結果

表4 最陡爬坡試驗設計及結果

2.5 中心復合序貫設計與響應面分析

采用中心復合序貫試驗對酵母浸粉、結晶乙酸鈉、吐溫-80的濃度配比進行優(yōu)化，以活菌數(shù)為響應值，試驗4（見表4）作為中心復合序貫試驗設計的中心點。各因子設置三個水平（見表5），共設計20組試驗，其中14組為析因點試驗，6組為中心點來估計試驗誤差，進行試驗得到以下結果（見表6）。

表5 中心復合序貫試驗設計因子水平

表6 中心復合序貫試驗設計及結果

對試驗結果統(tǒng)計分析并進行回歸擬合，得到預測活菌數(shù)的回歸擬合方程：Y=-985.596+8.423A+205.529E+127.024L-0.031A2-12.785E2-55.1L2-0.538AE-0.24AL。（Y為活菌數(shù)預測值，A、E、L分別代表酵母浸粉、結晶乙酸鈉和吐溫-80）對所得回歸方程進行方差分析（見表7）可知：模型的回歸項極顯著（P＜0.001）表明本模型是有效的，失擬項不顯著（P＞0.05）表明本模型不存在失擬現(xiàn)象，R-Sq與R-Sq（調整）比較接近，認為模型的擬合效果比較好；R-Sq（預測）比較接近于R-Sq值并且R-Sq（預測）值比較大，說明用此模型進行活菌數(shù)預測的效果可信。分析各項效應的顯著性可知除一次項吐溫-80和交互項乙酸鈉×吐溫-80不顯著外，其余項均顯著。

表7 回歸擬合方程方差分析

繪制活菌數(shù)響應值的等值線圖和曲面圖（見圖6和圖7）可直觀地看出各因子的交互作用對發(fā)酵活菌數(shù)的影響，從圖中可看出活菌數(shù)響應值存在最大值，使用響應優(yōu)化器計算活菌數(shù)的最大優(yōu)化響應值可得在酵母浸粉77.22 g/l，結晶乙酸鈉6.42 g/l，吐溫-80 0.99 g/l時預測發(fā)酵活菌數(shù)有最大響應值為61.07×108CFU/ml。

2.6 優(yōu)化配方檢驗

圖6 酵母浸粉和結晶乙酸鈉交互影響屎腸球菌活菌數(shù)的曲面圖和等值線圖

圖7 酵母浸粉和吐溫-80交互影響活菌數(shù)的曲面圖和等值線圖

為了檢驗優(yōu)化結果的實際效果，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基在相同條件下進行了5次搖瓶發(fā)酵試驗，由統(tǒng)計結果（見圖8）可知。屎腸球菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)所達到的平均發(fā)酵活菌數(shù)分別為61.36×108CFU/ml和13.26×108CFU/ml，試驗結果與預測值相近，證明回歸模型可靠，成功實現(xiàn)了屎腸球菌培養(yǎng)基的優(yōu)化。

3 討論

微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗以往多是采用單因素試驗結合正交試驗完成的，單因素試驗法只是研究某一個因子對目標值的作用效果，不能探索因子間的交互作用，多用于試驗中對眾多因素的最初篩選。正交試驗雖然可以得到培養(yǎng)基各組分濃度的最佳組合，但是無法找到整個試驗區(qū)域內目標響應值的最優(yōu)方案[12]。而Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗與中心復合響應面分析試驗是一套成熟高效的優(yōu)化試驗設計方法，它能用較少的試驗統(tǒng)計分析出達到目標響應值的最佳組合條件，彌補了正交試驗的不足，在多種工藝優(yōu)化試驗方面已運用成熟，現(xiàn)在在微生物發(fā)酵[13-14]、有效成分提取等[15]方面的應用也越來越多。Plackett-Burman試驗設計可以統(tǒng)計分析出整個試驗中各因子的顯著水平，從而確定出具有顯著影響作用的影響因子以進行下一步試驗[16]。最陡爬坡試驗是一種在Plackett-Burman試驗基礎上的梯度試驗設計方法，可以逼近顯著因子最優(yōu)響應值所在的響應區(qū)域，并以此作為中心復合試驗的中心點，然后采用響應面分析法得到各因子的最優(yōu)組合[17]。中心復合試驗及響應面分析能夠將試驗結果與試驗各因子進行統(tǒng)計回歸，分析各因子間的相互關系，擬合出以試驗結果為響應值的整體函數(shù)關系，通過響應值的回歸模型得出各因子最優(yōu)組合。

圖8 培養(yǎng)基優(yōu)化效果驗證

屎腸球菌是一種農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑使用的乳酸菌，具有調節(jié)動物腸道菌群平衡、促進營養(yǎng)物質吸收、增強抵抗力，提高生產(chǎn)性能等作用[18]。另外屎腸球菌也能夠抑制其他有害菌的生長[19]。因此將其開發(fā)為動物微生態(tài)制劑，應用到畜禽養(yǎng)殖業(yè)，或是作為寵物腸道保健品應用于寵物行業(yè)，都會有很高的應用價值。而將屎腸球菌投入工業(yè)化生產(chǎn)的前提，必須提高其發(fā)酵活菌量，本研究利用單因素試驗以及Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗與中心復合響應面分析試驗對屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化篩選。

研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基最適pH值為8.0，最適發(fā)酵溫度37℃，最佳碳源為麥芽糊精，最佳氮源為酵母浸粉。發(fā)酵活菌量的顯著影響因子是酵母浸粉、結晶乙酸鈉和吐溫-80，經(jīng)響應面分析法獲得的優(yōu)化高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方中酵母浸粉含量為77.22 g/l、結晶乙酸鈉為6.42 g/l、吐溫-80為0.99 g/l，其余成分含量保持不變，最終可得該屎腸球菌發(fā)酵最適培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉77.22 g/l、結晶乙酸鈉6.42 g/l、吐溫-80 0.99 g/l、檸檬酸二銨2.0 g/l、磷酸氫二鉀2.0 g/l、無水硫酸鎂0.2 g/l、硫酸錳0.04 g/l、麥芽糊精20 g/l。經(jīng)試驗驗證，優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵菌液活菌數(shù)可達6.136×109CFU/ml，與回歸模型的活菌數(shù)預測值相符。優(yōu)化結果是相同條件下MRS培養(yǎng)基菌液活菌數(shù)的4.63倍，成功實現(xiàn)了該屎腸球菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。