■朱永明 董偉潔 姜軍坡王世英 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001）

微生物源抗菌肽是由微生物分泌的可殺滅或抑制其他細(xì)菌、真菌的小分子多肽，相對(duì)分子質(zhì)量一般介于2 000～7 000 Da之間[1]?？咕木哂袩o(wú)殘留、無(wú)毒害、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[2-3]。

對(duì)微生物進(jìn)行誘變選育是提高微生物胞外產(chǎn)物產(chǎn)量的一種有效方法。杜康等[4]對(duì)巴氏芽孢桿菌YBB進(jìn)行微波誘變，篩選出兩株產(chǎn)脲酶更高的突變菌株，誘變菌株尿素分解能力較原菌株提高1.5倍左右，礦化能力提高114%；郭宏文等[5]對(duì)產(chǎn)異淀粉酶的黃桿菌菌株D15進(jìn)行紫外線誘變處理，獲得了1株產(chǎn)異淀粉酶活力較高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株ZYF32，比出發(fā)菌株提高了3.23倍；秦艷飛等[6]經(jīng)紫外-微波復(fù)合誘變，獲得1株P(guān)UM-13菌株，使那西肽搖瓶產(chǎn)量達(dá)883.450 μg/ml，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高了17.14%。

Bacillus velezensisTu-569菌株是本研究組從幼兔腸道中分離出的一株對(duì)大腸桿菌有抑菌活性的芽孢桿菌[7]。向斷奶仔兔日糧中添加Tu-569菌株制備的菌劑，可改善斷奶仔兔的生產(chǎn)性能，降低幼兔腹瀉率和死亡率[8]。本研究擬以抑制大腸桿菌能力為指標(biāo)，對(duì)Tu-569菌株進(jìn)行紫外-微波誘變選育，并以遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)正突變菌株的穩(wěn)定性，以獲得抑菌能力更強(qiáng)、遺傳更穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株；通過(guò)觀察高產(chǎn)菌株的菌落和菌體形態(tài)，以生理生化試驗(yàn)和API 50 CH細(xì)菌鑒定條綜合評(píng)測(cè)高產(chǎn)菌株生理生化特性，結(jié)合16S rDNA序列分析來(lái)鑒定高產(chǎn)菌株的種屬；通過(guò)考察硫酸銨鹽析、透析處理、蛋白酶處理、加熱處理、緩沖液pH值等對(duì)突變菌株胞外產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響，探索抑菌物質(zhì)的性質(zhì)，為將其開(kāi)發(fā)為抗菌肽制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種：Tu-569（Bacillus velezensis），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

指示菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）ETEC-44155，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室保存。

API 50 CH細(xì)菌鑒定條，由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)。

NB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基的組成參考文獻(xiàn)[9]，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成參考尚偉(2012)[7]。

生理生化特性試驗(yàn)所用試液的配制參考文獻(xiàn)[10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Tu-569菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

從Bacillus velezensisTu-569菌株斜面上挑取部分菌苔，接種于NB培養(yǎng)基中，裝瓶量為50 ml/250 ml，于37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，即得種子液。

按2%的接種量向裝瓶量為50 ml/250 ml的NB培養(yǎng)基中接入種子液，于37℃、180 r/min培養(yǎng)；每隔3 h取樣一次，以NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定600 nm下的OD值并繪制Tu-569菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 Tu-569菌株的紫外誘變選育

1.2.2.1 菌懸液的制備

將50 ml Tu-569菌株的種子液加入100 ml離心管中，9 000 r/min離心6 min，收集菌體。用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，再向菌體中加入適量的生理鹽水，振蕩，配制成濃度為108CFU/ml的菌懸液，備用。

1.2.2.2 紫外誘變處理

取無(wú)菌平皿（內(nèi)徑為9 cm），加入上述菌懸液5 ml，然后放入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上。將紫外燈（20 W）預(yù)熱30 min后，進(jìn)行不同時(shí)間（0～360 s）的紫外照射，照射距離為30 cm，每隔60 s取樣一次。將上述誘變處理后的菌懸液稀釋至10-6后涂NA平板；注意避光操作。以未經(jīng)紫外線處理的菌液作為對(duì)照，稀釋至10-6后涂NA平板。將上述NA平板置37℃培養(yǎng)；處理組NA平板需避光培養(yǎng)；24 h后觀察菌株生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

致死率(%)=（對(duì)照原菌液中的活菌數(shù)-處理后菌液中的活菌數(shù)）/對(duì)照原菌液中的活菌數(shù)×100。

1.2.2.3 初篩

大腸桿菌平板的制備方法參考文獻(xiàn)[11]。挑取處理組NA平板上生長(zhǎng)的菌落轉(zhuǎn)接于E.coli平板，培養(yǎng)24 h，測(cè)量菌落直徑和抑菌圈直徑，并以后者與前者之比計(jì)算圈徑比；將產(chǎn)生抑菌圈的菌株保存于NA斜面。在同一E.coli平板上同法測(cè)量Tu-569菌株產(chǎn)生的圈徑比；以Tu-569菌株對(duì)應(yīng)圈徑比為基準(zhǔn)，選取比其更大者作為復(fù)篩菌株。

1.2.2.4 復(fù)篩

將復(fù)篩菌株和Tu-569菌株分別接種于裝瓶量50 ml/250 ml的NB培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為50 ml/250 ml，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液。取發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min，取上清液待用。以瓊脂打孔擴(kuò)散法[12]測(cè)定各菌株發(fā)酵液的抑菌活性。選取比Tu-569菌株抑菌活性更大的菌株，作為正突變菌株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定。

1.2.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定

將正突變菌株與Tu-569菌株同時(shí)于NA斜面上連續(xù)傳代10次；利用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定各代菌株的抑菌活性，以抑菌活性為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)正突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 微波誘變選育高產(chǎn)菌株

以紫外誘變獲得的正突變菌株中遺傳最穩(wěn)定且活性較高者參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行微波誘變。制備該菌株的菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋至10-6；吸取500 μl加入1.5 ml的EP管內(nèi)。設(shè)置微波爐參數(shù)為P50，每次微波輻射EP管（于碎冰盒中進(jìn)行冰?。?0 s。進(jìn)行不同次數(shù)（1～10次）的微波輻射。每次輻射均使用新制碎冰，以減少微波熱效應(yīng)引起的菌體死亡。誘變結(jié)束后，吸取100 μl均勻涂布于NA平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察菌株生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

按1.2.2.3、1.2.2.4節(jié)和1.2.2.5節(jié)的方法對(duì)NA平板上的菌株進(jìn)行初篩、復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。以其中遺傳穩(wěn)定性最佳且抑菌活性較高者作為高產(chǎn)菌株。

1.2.4 高產(chǎn)菌株的鑒定

1.2.4.1 菌落和菌體形態(tài)觀察

將高產(chǎn)菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、表面、邊緣、透明度、隆起形狀等形態(tài)特征。以革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)和芽孢形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化特性測(cè)定

生理生化特性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10]中相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

分別將Tu-569和高產(chǎn)菌株接種于API 50 CH細(xì)菌鑒定條上，37℃孵育24 h，觀察顏色變化，以確定對(duì)不同碳源的利用情況。

1.2.4.3 16S rDNA序列分析

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行高產(chǎn)菌株總DNA的提取，并進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序，將所測(cè)出的16S rDNA序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的模式菌株序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 高產(chǎn)菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

1.2.5.1 硫酸銨鹽析抑菌物質(zhì)的效果

按1.2.2.4節(jié)的方法制備發(fā)酵上清液。分別向100.0 ml發(fā)酵上清液中加入硫酸銨，使其達(dá)到不同的飽和度，并將其4℃靜置過(guò)夜后，于10 000 r/min離心20 min，可得上清液和沉淀。所得沉淀用10.0 ml的Tris-HCl（pH值7.4）溶液溶解，即得溶解物。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定溶解物和上清液抑制大腸桿菌的活性。

1.2.5.2 透析處理鹽析沉淀的效果

將截留分子量為3.5 kDa和8.0 kDa的透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(15 cm左右）。8.0 kDa透析袋使用前需在含有2%（W/V）碳酸氫鈉和1 mmol/l EDTA（pH值8.0）的溶液中加熱煮沸10 min；用蒸餾水將其清洗3次；再在1 mmol/l EDTA（pH值8.0）中煮沸10 min。3.5 kDa透析袋使用前只需于蒸餾水中煮沸10 min即可。

按1.2.5.1節(jié)中方法制備70%飽和度硫酸銨鹽析對(duì)應(yīng)的溶解物，作為處理液，取20 ml轉(zhuǎn)移至透析袋中。在透析試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中，透析袋始終浸沒(méi)在溶液中，取透析袋的時(shí)候必須戴手套。將處理液加入透析袋中透析24 h；前4 h每隔1 h更換ddH2O 1次；之后4～6 h換ddH2O 1次，以徹底除去硫酸銨。透析完成后，測(cè)量透析袋內(nèi)截留液的體積；以透析前加入處理液的體積為基準(zhǔn)，計(jì)算截留液體積增大的倍數(shù)，作為稀釋倍數(shù)。按相同的稀釋倍數(shù)稀釋處理液，作為同比稀釋液。測(cè)定處理液、截留液和同比稀釋液的抑菌活性。

1.2.5.3 蛋白酶處理對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

將胰蛋白酶和胃蛋白酶分別用pH值8.0和pH值2.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成10 000 U/ml的溶液，并依次稀釋成1 000、100 U/ml的蛋白酶溶液。在3個(gè)不同的1.5 ml EP管中先加入500 μl按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對(duì)應(yīng)的溶解物，再加入500 μl蛋白酶溶液，使其終濃度達(dá)到5 000、500、50 U/ml。37 ℃孵育不同時(shí)間（30、60、90 min和120 min）后，分別加入500 μl酶反應(yīng)終止液，混合均勻，即得酶解液。

除以500 μl水代替500 μl蛋白酶溶液外，其余同上述操作，所得溶液作為陽(yáng)性對(duì)照液。

除以500 μl水代替500 μl溶解物外，其余同上述操作，所得溶液作為陰性對(duì)照液。

以瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液和酶解液的抑菌圈面積；不同濃度酶解液的抑菌圈面積與相應(yīng)陰性對(duì)照之差即為抑菌物質(zhì)在該濃度酶解液對(duì)應(yīng)的抑菌活性。

1.2.5.4 pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

取500 μl按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對(duì)應(yīng)的溶解物，加入1.5 ml EP管中，再按1∶1體積分別加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），混合均勻后，4℃靜置1 h，作為處理液。以相應(yīng)pH值的磷酸-檸檬酸緩沖液代替溶解物作為陰性對(duì)照；以蒸餾水代替磷酸-檸檬酸緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照。以瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定處理液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的抑菌圈面積；處理液的抑菌圈面積與相應(yīng)陰性對(duì)照之差即為抑菌物質(zhì)在該pH值下對(duì)應(yīng)的抑菌活性。

1.2.5.5 加熱處理對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

取1 ml按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對(duì)應(yīng)的溶解物，分別在40、60、80、100℃和121℃下加熱處理30、60 min，然后立即放入碎冰盒中冷卻，靜置1 h后即得處理液。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定處理液抑菌活性，以未處理的溶解物作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu-569菌株的生長(zhǎng)曲線

Tu-569菌株的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，0～6 h為延滯期；7～15 h為對(duì)數(shù)期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)旺盛；16～25 h為穩(wěn)定期；26 h后進(jìn)入衰亡期。誘變一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期，這時(shí)菌體生長(zhǎng)速度快，因此選用種齡12 h的種子液進(jìn)行誘變選育。

2.2 Tu-569菌株的紫外誘變結(jié)果

由圖2可知，隨著紫外線照射時(shí)間的增加，Tu-569菌株的致死率逐漸增大，360 s時(shí)致死率達(dá)到100%。紫外線照射180 s時(shí)，致死率為63.3%；紫外線照射240 s時(shí)，致死率達(dá)到81.2%；紫外線照射300 s時(shí)，致死率為95.7%。一般認(rèn)為當(dāng)致死率在80%～90%之間時(shí)，菌株的變異正突變概率大且可以穩(wěn)定遺傳[15]。因此，選擇紫外線照射時(shí)間為240 s時(shí)的菌株進(jìn)行初篩。

圖1 Tu-569菌株的生長(zhǎng)曲線

圖2 紫外誘變的致死率曲線

Tu-569菌株紫外誘變的初篩、復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表1。從結(jié)果可知，初篩得到9株圈徑比大于原菌株Tu-569的正突變菌株，其中T-4M-5突變株的圈徑比最大，達(dá)到2.20。復(fù)篩時(shí)，T-4M-5、T-4M-26、T-4M-11突變株的抑菌圈面積較大，分別是原菌株的1.79、1.69、1.61倍。

表1 Tu-569菌株紫外誘變初篩、復(fù)篩結(jié)果

T-4M-5、T-4M-11、T-4M-26突變株的遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2。連續(xù)傳代10次后，T-4M-5、T-4M-11、T-4M-26突變株抑菌圈面積較第一代分別降低了4.0%、20.8%、24.0%，說(shuō)明T-4M-11、T-4M-26遺傳穩(wěn)定性較差，而T-4M-5菌株遺傳穩(wěn)定性良好。故選擇T-4M-5菌株進(jìn)行微波誘變。

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

2.3 微波誘變選育高產(chǎn)菌株

用微波誘變T-4M-5菌株的致死率曲線如圖3所示。隨著處理時(shí)間的增加，致死率逐漸升高；在微波輻照30～70 s范圍內(nèi)，致死率上升較快；微波處理50 s時(shí)，致死率為62.6%；微波處理60 s時(shí)，致死率為78.2%；當(dāng)微波處理70 s時(shí)，致死率為85.2%；當(dāng)微波處理90 s時(shí)，致死率達(dá)到100%。選擇微波處理60 s和70 s的菌株進(jìn)行初篩。

圖3 T-4M-5菌株微波誘變致死率曲線

T-4M-5菌株微波誘變的初篩、復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表3。篩選出12株圈徑比較大的突變菌株，其中T-70-1突變株的圈徑比最大，達(dá)到3.10。經(jīng)復(fù)篩后T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株的抑菌圈面積分別是出發(fā)菌株的1.53倍、1.34倍、1.47倍、1.33倍。

表3 T-4M-5菌株微波誘變初篩、復(fù)篩結(jié)果

將T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株的遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2。連續(xù)傳代十次后，T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株抑菌效果分別降低了5.6%、5.1%、9.8%、7.4%，說(shuō)明這四株菌遺傳穩(wěn)定性較好，其中T-70-1菌株的抑菌圈面積最大，達(dá)到343.3 mm2。因此選擇T-70-1菌株作為高產(chǎn)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 高產(chǎn)菌株的鑒定

2.4.1 高產(chǎn)菌株的菌體形態(tài)與菌落形態(tài)

高產(chǎn)菌株T-70-1的菌落、菌體形態(tài)如圖4所示。由結(jié)果可知，T-70-1菌株菌落呈乳白色，近圓形，培養(yǎng)后期邊緣突出呈火山口狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密難挑取，質(zhì)地黏稠。T-70-1菌株的革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體為桿狀，芽孢中生。與原菌株Tu-569相比，無(wú)差別。

圖4 T-70-1菌株的菌落與菌體形態(tài)

2.4.2 高產(chǎn)菌株的生理生化試驗(yàn)

原菌株Tu-569和高產(chǎn)菌株T-70-1的生理生化特性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4和圖5。由表4可知，兩菌株有以下不同之處：T-70-1菌株不產(chǎn)接觸酶，而Tu-569菌株產(chǎn)接觸酶；T-70-1菌株可在含10%、15%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而Tu-569菌株不能。除此之外的生理生化特性，兩菌株相同。由圖5可知，T-70-1菌株可利用D-半乳糖（10）和D-塔格糖（42）生長(zhǎng)，而Tu-569菌株不能。兩菌株都可利用淀粉、肌醇、D-果糖等24種碳源；都不能利用D-阿拉伯糖、L-山梨糖、L-鼠李糖等23種碳源。依據(jù)T-70-1菌株的生理生化特性，可將其歸為芽孢桿菌屬。

表4 Tu-569菌株和T-70-1菌株的生理生化試驗(yàn)對(duì)比

圖5 24 h API 50試紙條顏色反應(yīng)結(jié)果

2.4.3 高產(chǎn)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

高產(chǎn)菌株的16S rDNA序列相似性分析結(jié)果見(jiàn)表5，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。供試菌株T-70-1與15株模式菌株的16S rDNA序列的相似度均高于90%，其中T-70-1菌株與Bacillus velezensis模式菌株CR-502的16S rDNA序列的相似性最高，達(dá)到99.93%。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，T-70-1菌株與Bacillus velezensis的同源性最高。故初步鑒定T-70-1菌株為Bacillus velezensis。

2.5 高產(chǎn)菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)分析

2.5.1 硫酸銨鹽析抑菌物質(zhì)的結(jié)果

不同飽和度硫酸銨鹽析T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的結(jié)果見(jiàn)圖7。由結(jié)果可知，在30%～70%的硫酸銨飽和度范圍內(nèi)，隨著硫酸銨飽和度的增加，溶解物的抑菌活性逐漸增大；當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到70%時(shí)，抑菌活性最大，抑菌圈面積為361.7 mm2；在70%～100%的硫酸銨飽和度范圍內(nèi)，隨著硫酸銨飽和度的增加，溶解物的抑菌活性稍有波動(dòng)，但是差異不顯著（P＞0.05）。故選取70%硫酸銨飽和度為沉淀抑菌物質(zhì)的最佳飽和度。

表5 高產(chǎn)菌株T-70-1的16S rDNA序列的相似性分析結(jié)果

圖6 高產(chǎn)菌株T-70-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7 硫酸銨飽和度對(duì)鹽析后抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.2 透析袋截留分子量對(duì)截留液活性的影響

采用截留分子量為3.5、8.0 kDa的透析袋處理菌株硫酸銨鹽析溶解物的結(jié)果見(jiàn)圖8，硫酸銨溶解物經(jīng)3.5 kDa透析袋透析處理后，截留液仍具有抑菌活性，其對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積為稀釋液的81.6%；8.0 kDa透析袋的截留液沒(méi)有形成抑菌圈，無(wú)抑菌活性。故采用3.5 kDa透析袋可有效截留T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)，推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～8.0 kDa之間。

2.5.3 蛋白酶處理對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

胰蛋白酶對(duì)T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響見(jiàn)圖9。由結(jié)果可知，在50～5 000 U/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著胰蛋白酶酶活力的增加，在相同反應(yīng)時(shí)間下，酶活力越高，則抑菌物質(zhì)的活性越低；酶活力相同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，抑菌活性也逐漸降低。蛋白酶濃度為50 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的90.7%；當(dāng)?shù)鞍酌笣舛仍黾拥?00 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的76.7%；當(dāng)胰蛋白酶濃度增加到5 000 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的62.4%。

圖8 T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的透析試驗(yàn)結(jié)果

胃蛋白酶對(duì)T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響見(jiàn)圖10。由圖10可知，在50～5 000 U/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著胃蛋白酶酶活力的增加，在相同反應(yīng)時(shí)間下，酶活力越高，則抑菌物質(zhì)的活性越低；酶活力相同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，抑菌活性也逐漸降低。胃蛋白酶濃度為50 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的83.4%；當(dāng)胃蛋白酶濃度增加到500 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的72.3%。當(dāng)胃蛋白酶濃度增加到5 000 U/ml時(shí)，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對(duì)應(yīng)抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈面積的49.1%。

綜上所述，高濃度的胰蛋白酶或胃蛋白酶均可使T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性降低，說(shuō)明抑菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有可被兩種酶作用的肽鍵。而與中等濃度的兩種蛋白酶反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)仍有較高活性，說(shuō)明抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

圖10 胃蛋白酶對(duì)T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.4 pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

pH值對(duì)高產(chǎn)菌株T-70-1胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響如圖11所示。在pH值2.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的上升，抑菌活性也逐漸增強(qiáng)；在pH值7.0～10.0范圍內(nèi)，隨著pH值的上升，抑菌活性逐漸降低。當(dāng)pH值為7.0時(shí)抑菌活性最高，抑菌圈面積為406.6 mm2；在pH值2.0時(shí)抑菌活性最低，為陽(yáng)性對(duì)照的38.5%；當(dāng)pH值為10.0時(shí)其抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照的47.8%。當(dāng)pH值為3.0時(shí)其抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照的51.5%；當(dāng)pH值為9.0時(shí)其抑菌圈面積為陽(yáng)性對(duì)照的53.0%，故T-70-1菌株產(chǎn)胞外抑菌物質(zhì)在pH值3.0～9.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性。

圖11 pH值對(duì)T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.5 加熱處理對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

如圖12所示，當(dāng)加熱溫度為40、60℃時(shí)，分別處理30 min和60 min后，抑菌圈面積無(wú)明顯變化。當(dāng)加熱溫度為80℃時(shí)，處理30 min后，抑菌圈面積降低了11.7%；加熱60 min后，抑菌圈面積降低了13.7%。當(dāng)加熱溫度為100℃時(shí)，處理30 min后，抑菌圈面積降低了25.1%；加熱60 min后，抑菌圈面積降低了30.1%；121℃處理后，抑菌物質(zhì)無(wú)抑菌活性。綜上可知，菌株T-70-1胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)100℃以下溫度有較強(qiáng)的耐受性。

圖12 溫度對(duì)T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

傳統(tǒng)抗生素的大量使用導(dǎo)致的耐藥性問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重威脅人們的健康；開(kāi)發(fā)促生長(zhǎng)、抗腹瀉的新型飼料添加劑已成為研究熱點(diǎn)。孫雪梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬教槽料和保育料中添加天蠶素抗菌肽（300 g/t），有明顯提高日增重和減少腹瀉的功效。王曦堯[16]研究表明，日糧中添加抗菌肽（350 mg/kg）可明顯促進(jìn)吉戎兔生長(zhǎng)，降低料重比。呂尊周等[17]用抗菌肽粗提物飼喂肉雞發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以抑制腸道中大腸桿菌，促進(jìn)乳酸桿菌等，提高飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。本研究所使用的誘變?cè)季闠u-569可改善斷奶仔兔的生產(chǎn)性能，降低幼兔腹瀉率和死亡率[8]，其作為野生型菌株，抑菌活性尚有提高的空間。

選育高產(chǎn)菌株可有效降低發(fā)酵成本。使用單一誘變育種方法，存在突變無(wú)法定向、突變率低、遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[18]。采用復(fù)合誘變的方法，能更好地改善菌株的性能。何淼等[19]以鏈霉菌SN03菌株為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變結(jié)合微波誘變的處理方法，獲得了高效菌株UV-1-W3，其發(fā)酵液對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到33.2 mm，抗菌活性比出發(fā)菌株提高了30.2%。李海娜[20]以乳酸鏈球菌ATCC11454為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、微波、亞硝酸鈉并用的方法最終選育出一株遺傳特性穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，該菌株效價(jià)達(dá)到6 200 IU/ml，較原始菌株提高了5倍；通過(guò)10 L發(fā)酵罐中試生產(chǎn)Nisin效價(jià)達(dá)到9 600 IU/ml左右，大大降低了發(fā)酵成本。本研究通過(guò)對(duì)Tu-569菌株進(jìn)行紫外-微波誘變，得到了1株性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株T-70-1，其抑菌活性是原菌株的2.74倍。

T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)可被70%飽和度的硫酸銨鹽析；該抑菌物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～8.0 kDa之間；抑菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有可被胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的肽鍵；故T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)為抗菌肽。Tu-569菌株胞外產(chǎn)抗菌物亦為抗菌肽[7]。兩菌株的抗菌肽對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量均在3.5～8.0 kDa之間。

Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽在pH值9.0時(shí)抑菌活性最高，在pH值5.0～10.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性；而T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽在pH值7.0時(shí)抑菌活性最高，在pH值3.0～9.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性。畜禽動(dòng)物胃液pH值在1.5～2.0之間，腸液pH值一般為8.0～9.0，故胃腸液pH值環(huán)境中T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽能保持較高活性。畜禽動(dòng)物胃液中胃蛋白酶濃度約為500 U/ml；胰蛋白酶濃度約為250 U/ml[21]。Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽用500 U/ml的胃蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來(lái)的18.8%；用250 U/ml的胰蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來(lái)的33.3%。T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)濃度為500 U/ml胰蛋白酶處理120 min后，抑菌活性是原來(lái)的76.7%；抗菌肽經(jīng)濃度為500 U/ml胃蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來(lái)的72.3%。因此，與胃腸液中存在的蛋白消化酶發(fā)生作用后，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽也保留著大部分的抑菌活性。T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽很適宜在畜禽胃腸道環(huán)境中發(fā)揮抑菌作用。Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)100℃處理30 min后，抑菌活性完全喪失，而T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)100℃加熱60 min后，抑菌圈面積僅降低了30.1%，耐熱性提高，有利于將其制備成粉劑。

綜上所述，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽耐受畜禽動(dòng)物胃腸液pH值環(huán)境，適宜在畜禽胃腸道環(huán)境中發(fā)揮抑菌作用，還可耐受高溫處理，為將其制備成新型飼料添加劑并應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)，有著良好的應(yīng)用前景。

3.2 結(jié)論

經(jīng)紫外-微波誘變獲得了1株高產(chǎn)抗菌肽、遺傳穩(wěn)定的T-70-1菌株，與原菌株Tu-569同屬于Bacillus velezensis種屬。T-70-1菌株除不產(chǎn)接觸酶、可耐受10%和15%的NaCl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外，其余生理生化特性與Tu-569菌株均相同。與原菌株Tu-569相比，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽抑菌活性更強(qiáng)，是原菌株的2.74倍，性質(zhì)更為穩(wěn)定，具體表現(xiàn)在更耐受胃腸道環(huán)境，更為耐熱，可將其制備成粉劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。