徐寶欣，杜義龍，潘海峰，李艷榮

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

益心酮片HPLC指紋圖譜的構(gòu)建*

徐寶欣，杜義龍，潘海峰，李艷榮△

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

目的:構(gòu)建益心酮片的HPLC指紋圖譜。方法：采用HPLC法建立13批益心酮片的指紋圖譜。色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm），流動相為A：0.1%甲酸-水混合溶液、B：乙腈、C：四氫呋喃，梯度洗脫，流速為1.0ml/min，檢測波長350nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl。使用中藥指紋圖譜相似度評價軟件（版本2004 A）進(jìn)行相似度分析。結(jié)果：根據(jù)13批益心酮片的指紋圖譜檢測結(jié)果，共標(biāo)定出10個共有峰，13批益心酮片的相似度均大于0.99。結(jié)論：該方法操作簡單、可靠，重復(fù)性強(qiáng)，結(jié)果比較穩(wěn)定，適用于益心酮片的質(zhì)量評價。

益心酮片；高效液相色譜；指紋圖譜

益心酮片收載于2015年版《中國藥典》一部，是以山楂葉提取物為原料制成的成方制劑，具有活血化瘀、宣通血脈的功效。在質(zhì)量控制方面，現(xiàn)行藥典采用HPLC法控制益心酮片中牡荊素鼠李糖苷和牡荊素葡萄糖苷的總量[1]，文獻(xiàn)[2-5]也多集中在含量測定方面。基于中藥成份的復(fù)雜性，僅控制一個或幾個成分的含量難以全面表征其質(zhì)量。目前，中藥指紋圖譜作為一種被廣泛認(rèn)可的中藥質(zhì)量評價及控制模式，能夠比較全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量[6-8]。為了更好更全面地控制益心酮片的質(zhì)量，保證臨床療效，本文建立了益心酮片的指紋圖譜，以期為有效控制和科學(xué)評價其質(zhì)量提供簡便、準(zhǔn)確可行的方法。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1200 Series高效液相色譜儀，色譜工作站Agilent Chemstation(美國安捷倫公司)；十萬分之一電子分析天平（型號：AG-245）；高速離心機(jī)（型號：HC-2062）；超聲波清洗器（型號：KQ-700）。

試劑：乙腈、甲醇為色譜純（Fisher Scientific，USA），四氫呋喃為色譜純（Mreda Technology Inc，USA）；其他試劑均為分析純。

對照品：綠原酸(批號110753-200413)、牡荊素(批號111687-200602)、牡荊素鼠李糖苷(批號111668-200602)、蘆丁(批號100080-200707)、金絲桃苷(批號111521-201004)，均購于中國藥品生物制品檢定所；牡荊素葡萄糖苷（批號為A0513），購自成都曼思特生物科技有限公司。以上對照品均供含量測定用。

益心酮片：益心酮片共13批。S001-S004，山西省恒山中藥有限責(zé)任公司（批號：130201、130301、130401、131101）；S005-S007，山西振東泰盛制藥有限公司（批號：1301251、1303291、1310272）；S008-S009，海南天煌制藥有限公司（批號：130202、130703、131106）；S010-S011，山西昂生藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號：130601、130701）；S012-S013，湖南方勝制藥股份有限公司（批號：131101、140301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6mm×250mm），流動相：A：0.1%甲酸-水混合溶液、B：乙腈、C：四氫呋喃，梯度洗脫：t（min）：0-20-30-40-50，A（90%-84%-84%-78%-74%）、B（8%-14%-14%-20%-24%）、C（2%-2%-2%-2%-2%）；檢測波長為350nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制：分別精密稱定各對照品適量，加色譜甲醇，溶解，得到每1ml含0.30mg牡荊素、1.00mg牡荊素鼠李糖苷、0.08mg蘆丁、0.40mg綠原酸、0.30mg金絲桃苷和0.80mg牡荊素葡萄糖苷的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的配制：取益心酮片研細(xì)（過五號篩），精密稱定0.3g，置25ml容量瓶，先加15ml的70%甲醇溶解后，再加至刻度，精密稱定總重量，超聲處理20min，放至室溫，用70%甲醇補(bǔ)充減失的重量，濾過，取續(xù)濾液離心10min（12000r/min），用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3 益心酮片指紋圖譜的建立與分析

2.3.1 方法學(xué)考察：

⑴精密度試驗(yàn)：取S001批益心酮片細(xì)粉制得供試品溶液（按2.2.2項(xiàng)下方法制得），設(shè)置色譜條件（2.1項(xiàng)），連續(xù)6次進(jìn)樣。結(jié)果測得共有峰相對峰面積的RSD均小于1.7%，相對保留時間的RSD均小于1.4%，表明該實(shí)驗(yàn)有良好的精密度。

⑵重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份益心酮片細(xì)粉（S001）供試品溶液（按2.2.2項(xiàng)下方法制備），按2.1項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算各共有峰的相對峰面積及相對保留時間并進(jìn)行分析。結(jié)果相對峰面積的RSD均小于2.0%，相對保留時間的RSD均小于1.3%，表明該實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性。

⑶穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S001批益心酮片細(xì)粉制得供試品溶液（按2.2.2項(xiàng)下方法制備），設(shè)置色譜條件（見2.1項(xiàng)色譜條件），進(jìn)樣時間分別為0h、2h、4h、8h、12h、24h，分析各峰的相對峰面積及相對保留時間。結(jié)果相對峰面積的RSD均小于2.3%，相對保留時間的RSD均小于1.5%，結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.2 益心酮片指紋圖譜的確定：13批益心酮片按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法設(shè)置色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄各色譜圖。使用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（版本2004 A）進(jìn)行相似度處理，設(shè)定S001批圖譜為參照圖譜，將其它樣品的色譜峰與參照圖譜自動進(jìn)行匹配，對照圖譜按中位數(shù)法生成并進(jìn)行處理，建立益心酮片的指紋圖譜疊加圖。見圖1：

圖1 益心酮片指紋圖譜疊加圖

2.3.3 共有峰的標(biāo)定：根據(jù)13批益心酮片指紋圖譜的檢測結(jié)果，通過相似度評價軟件，共標(biāo)出10個共有峰(圖2)。圖2中3號峰(牡荊素葡萄糖苷)分離度較好，峰面積也比較穩(wěn)定，故選擇此峰作為參照峰。經(jīng)與對照品比對，共對比出6個化合物。

圖2 益心酮片對照指紋圖譜

2.3.4 益心酮片指紋圖譜相似度評價：對13批益心酮片的液相數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并和對照品指紋圖譜進(jìn)行匹配，13批益心酮片的相似度分別為：0.999、0.999、0.998、0.997、0.998、0.997、0.993、0.997、0.995、0.995、0.997、0.999和0.996。

3 討論

本研究采用常規(guī)HPLC法建立了益心酮片指紋圖譜，為了使指紋圖譜提供更多的信息，前期對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化（色譜柱、流動相、檢測波長等）。結(jié)果顯示，本研究中所使用的色譜條件使得各色譜峰均有較好的分離效果，且峰個數(shù)多，能夠用于實(shí)驗(yàn)研究。

本研究建立了13批不同廠家益心酮片的指紋圖譜，采用指紋圖譜軟件共標(biāo)定出10個共有峰，通過與對照品比對對比出6個化合物，相似度均大于0.9，說明所建立的指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性，能為益心酮片的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.1402.

[2]于淼，原源.HPLC法測定益心酮片中四種黃酮類成分的含量[J].東南國防醫(yī)藥，2015，1（72）：157-159，165.

[3]楊明宇，王領(lǐng)弟，杜義龍，等.高效液相色譜法測定不同廠家益心酮片中6種成分的含量[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，33(4)：273-275.

[4]趙彩云，王強(qiáng).HPLC法測定益心酮片中五種成分的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2011，12(2)：113-116.

[5]鄒平，劉桂平，劉輝，等.益心酮口腔崩解片的制備和質(zhì)量控制[J].中國藥師，2013，16(4)：562-564.

[6]張婷，鄭奪，王文彤，等.指紋圖譜結(jié)合一測多評模式在參芎養(yǎng)心顆粒質(zhì)量評價中的應(yīng)用研究[J].中草藥，2015，46(13)：1920-1925.

[7]邵建強(qiáng).中藥指紋圖譜的研究進(jìn)展[J].中草藥，2009，40(6)：994-998.

[8]周建良，齊煉文，李萍.色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].色譜，2008，26(2)：153-159.

CONSTRUCTION OF HPLC FINGERPRINT OF YIXINTONG TABLETS

XU Bao-xin, DU Yi-long, PAN Hai-feng, et al

(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To construct the HPLC fingerprint of Yixintong tablets. Methods:The HPLC was used to construct the fi ngerprint of 13 batches Yixintong tablets with the condition that the column was ZORBAX SB-C18column (5μm,4.6mm×250mm); the mobile phase was eluted with gradient by 0.1% formic acid-water, acetonitrile and tetrahydrofuran; the fl ow rate was 1.0ml/min; the detection wavelength was 350nm; the column temperature was 30℃; the sample volume was 10μl. The similarity evaluation software (2004A version) was used for similarity analysis.Results:The HPLC fingerprints of 13 batches Yixintong tablets calibrated 10 common peaks, and the similarity were all higher than 0.99.Conclusions:The method is simple, stable and feasible, and can be used to evaluate the quality of Yixintong tablets.

Yixintong tablets; HPLC; Fingerprint

R917

A

1004-6879（2018）01-0006-03

* 河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2015097），河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2014063），河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助

△ 通訊作者

2017-04-28）