陳俊，楊自金

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院兒內(nèi)科，江蘇 連云港 222002)

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是存在于人臍帶血中的一種成體干細(xì)胞，具有旺盛的自我更新能力以及向多胚層分化的潛能[1]。在適宜的條件下，臍血MSC能分化為神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且能夠分泌多種細(xì)胞活性因子，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、減少凋亡、細(xì)胞替代等機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的修復(fù)[2-3]。臍血MSC還具有免疫原性低、來(lái)源廣泛、倫理爭(zhēng)議少等優(yōu)點(diǎn)[4]，因此成為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的一種有前途且極具吸引力的種子細(xì)胞。

1 臍血MSC向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化

1.1化學(xué)試劑誘導(dǎo)抗氧化劑作為最常見(jiàn)的化學(xué)誘導(dǎo)劑廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究中，早年研究使用的有β-琉基乙醇(βME)、二甲基亞砜(DMSO)、丁基羥基茴香醚(BHA)等。近年研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸(AsA)、維A酸(RA)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)及腺苷酸環(huán)化酶激活劑毛喉素(Forskolin)也具有誘導(dǎo)分化作用。其中RA屬于維生素A的衍生物，Jin等[5]在使用不同濃度的全反式維甲酸(ATRA)對(duì)臍血MSC進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)：ATRA既能夠誘導(dǎo)臍血MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化，同時(shí)也能驅(qū)使細(xì)胞凋亡，這兩種不同機(jī)制具有劑量依賴性，當(dāng)劑量為0.5 μmol時(shí)細(xì)胞分化效果最佳且凋亡最少。另外，IBMX和Forskolin能夠提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平從而激活cAMP依賴蛋白激酶(PKA)，最終效應(yīng)也是增加細(xì)胞分化和誘發(fā)細(xì)胞凋亡。對(duì)此，Shahbazi等[6]首次嘗試使用IBMX和Forskolin作為誘導(dǎo)劑對(duì)臍血MSC進(jìn)行誘導(dǎo)，并成功誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞。在誘導(dǎo)8 h后通過(guò)免疫化學(xué)法檢測(cè)到神經(jīng)元表面特異標(biāo)志物巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)均陽(yáng)性表達(dá)。

由于化學(xué)試劑存在細(xì)胞毒性作用，如RA長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)被公認(rèn)為是一種致畸劑[7]，且在大劑量時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此這些化學(xué)試劑的誘導(dǎo)機(jī)制以及安全誘導(dǎo)劑量還需深入研究。

1.2細(xì)胞因子誘導(dǎo)目前可作為誘導(dǎo)劑的已知細(xì)胞因子包括表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等。其中，EGF和bFGF是兩種廣譜的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，常作為預(yù)誘導(dǎo)劑提高誘導(dǎo)效率[8]。BDNF則廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過(guò)與特異性受體 TrkB結(jié)合激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]，其誘導(dǎo)效果已被廣泛認(rèn)可。新發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)作用的IGF是一類(lèi)多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，Hussain、Waheed等[10]使用IGF-1誘導(dǎo)臍血MSC，成功誘導(dǎo)出nestin標(biāo)記陽(yáng)性的神經(jīng)樣細(xì)胞。

近年研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)或細(xì)胞因子聯(lián)合化學(xué)試劑誘導(dǎo)的方法能夠有效提高誘導(dǎo)效率，可以彌補(bǔ)單個(gè)細(xì)胞因子誘導(dǎo)效率較低的缺點(diǎn)，因此成為目前的研究熱點(diǎn)。Salehinejad等[11]使用細(xì)胞因子EGF、bFGF以及化學(xué)試劑RA、DMSO進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的臍血MSC向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，通過(guò)檢測(cè)對(duì)比神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin和GFAP的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)聯(lián)合誘導(dǎo)組的誘導(dǎo)效率明顯高于單獨(dú)誘導(dǎo)組。Rafieemehr等[12]則在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出了兩步誘導(dǎo)法：先將RA、EGF、bFGF作為預(yù)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2 d，棄去預(yù)誘導(dǎo)劑后加入NGF、IBMX、AsA正式誘導(dǎo)6 d，誘導(dǎo)后細(xì)胞通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)到神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物MAP2、髓鞘堿性蛋白(MBP)和GFAP均高表達(dá)，成功誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞并且誘導(dǎo)效率明顯提高，并認(rèn)為RA相比其他誘導(dǎo)劑在促進(jìn)細(xì)胞分化的過(guò)程中起到了更為關(guān)鍵的作用。

細(xì)胞因子與化學(xué)試劑相比，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有存活率高、毒副作用小，誘導(dǎo)效率較低的缺點(diǎn)，但可以通過(guò)聯(lián)合誘導(dǎo)的方案解決，因此應(yīng)用前景更加廣泛。

1.3移植、共培養(yǎng)誘導(dǎo)通過(guò)將臍血MSC移植入宿主神經(jīng)組織，或與神經(jīng)組織細(xì)胞體外共培養(yǎng)，觀察移植或共培養(yǎng)后臍血MSC的發(fā)育、分化及作用情況。目前主要的細(xì)胞移植方法有：(1)側(cè)腦室注射移植法:經(jīng)立體定位儀定位后，通過(guò)側(cè)腦室穿刺將細(xì)胞注射入側(cè)腦室，使其隨腦脊液到達(dá)病變部位；(2)直接移植法:通過(guò)手術(shù)或其他技術(shù)手段將細(xì)胞直接移植于病變部位；(3)椎管內(nèi)植入法:將細(xì)胞通過(guò)腰椎穿刺術(shù)注射入蛛網(wǎng)膜下腔，使其隨腦脊液到達(dá)病變部位；(4)靜脈注射移植法:將細(xì)胞通過(guò)靜脈輸入，使其通過(guò)血腦屏障到達(dá)病變部位。Cui等[13]將臍血MSC直接移植到脊髓損傷大鼠的神經(jīng)受損部位，移植4周后行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)移植到受損部位的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)志物NSE和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，同時(shí)大鼠脊髓損傷模型的后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分也較損傷前提高，說(shuō)明臍血MSC移植后能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞并對(duì)損傷神經(jīng)組織進(jìn)行修復(fù)。Miao等[14]通過(guò)腰椎穿刺鞘內(nèi)注射臍血MSC的方法，對(duì)接受注射的100名神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者進(jìn)行治療隨訪，結(jié)果表明此方法對(duì)于脊髓損傷、腦癱、腦梗死、腦外傷綜合征等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復(fù)均具有一定的療效，其作用機(jī)制可能與上述實(shí)驗(yàn)相同，即臍血MSC移植到體內(nèi)后能夠在神經(jīng)受損部位聚集并進(jìn)行修復(fù)有關(guān)。類(lèi)似于移植誘導(dǎo)法，共培養(yǎng)誘導(dǎo)法是在體外利用神經(jīng)組織細(xì)胞提供的生長(zhǎng)環(huán)境來(lái)培養(yǎng)并促進(jìn)細(xì)胞的分化。Zeng等[15]使用嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)臍血MSC進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)，經(jīng)共培養(yǎng)后的細(xì)胞神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE陽(yáng)性表達(dá)，并成功檢測(cè)到神經(jīng)電生理活動(dòng)。上述研究表明，神經(jīng)組織細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中提供的微環(huán)境對(duì)臍血MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞具有誘導(dǎo)促進(jìn)作用，其原理可能與微環(huán)境中存在能夠誘導(dǎo)臍血MSC分化的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)，這為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的開(kāi)展提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.4基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是將某些細(xì)胞因子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到臍血MSC中后，通過(guò)不斷分泌這種具有誘導(dǎo)分化作用的細(xì)胞因子，以實(shí)現(xiàn)自我誘導(dǎo)。由于BDNF具有促進(jìn)受損神經(jīng)元再生的作用，并且能夠誘導(dǎo)臍血MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞。Hei等[16]利用腺病毒載體將BDNF轉(zhuǎn)染入臍血MSC，然后將轉(zhuǎn)染后的臍血MSC移植到坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型中，4周后通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和熒光實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合本群酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組BDNF蛋白以及mRNA的表達(dá)水平均明顯升高。另外通過(guò)軸突計(jì)數(shù)、軸突密度測(cè)定和坐骨神經(jīng)功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組神經(jīng)損傷部位的再生程度明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，這些結(jié)果表明經(jīng)BDNF轉(zhuǎn)染后的臍血MSC能夠不斷分泌BDNF，以提高損傷局部BDNF濃度并且成功自誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，最終達(dá)到修復(fù)神經(jīng)損傷的目的。

臍血MSC的生存壽命有限，對(duì)生存環(huán)境要求較高，阻礙了其在臨床上的應(yīng)用，端粒反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，能夠促進(jìn)缺血缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的增殖和存活[17]，新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍產(chǎn)期窒息引起腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的腦損傷性疾病，如果使用TERT和BDNF基因共修飾臍血MSC，就能在提高臍血MSC生存率的同時(shí)對(duì)受損神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)，可能成為治療HIE的一種新方法[18]。

雖然基因轉(zhuǎn)染法能夠在不使用誘導(dǎo)劑的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自誘導(dǎo)，但也存在轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差甚至死亡的可能，限制了其臨床應(yīng)用。

1.5中藥誘導(dǎo)中藥注射液如丹參、香丹、黃芩苷等能夠誘導(dǎo)臍血MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化。Nan等[19]近來(lái)發(fā)現(xiàn)川芎嗪也具備誘導(dǎo)臍帶MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力，這些研究引發(fā)了廣泛地關(guān)注及后續(xù)研究。有研究者通過(guò)設(shè)置不同類(lèi)型的誘導(dǎo)組合對(duì)臍血MSC進(jìn)行誘導(dǎo)[20]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參素+生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組(丹參素+EGF+bFGF)的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于單純細(xì)胞因子誘導(dǎo)組(EGF+bFGF)、單純化學(xué)試劑誘導(dǎo)組(βME+DMSO+BHA)以及化學(xué)試劑+細(xì)胞因子誘導(dǎo)組(RA+EGF/ BDNF+bFGF)，展示了中藥聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的高效性及今后臨床應(yīng)用的可行性。

中藥誘導(dǎo)劑價(jià)格便宜，毒副作用較小，在治療方法上可選擇口服或靜脈注射，也可用于臍血MSC移植后的體內(nèi)誘導(dǎo)分化，臨床應(yīng)用方便。但中藥誘導(dǎo)劑的有效成分暫不十分明確，且存在純度不均一的問(wèn)題。此外，為了更好、更安全地應(yīng)用于臨床治療，其誘導(dǎo)分化的具體作用機(jī)制以及用量問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。

2 應(yīng)用與展望

臍血MSC相比早前研究使用的神經(jīng)干細(xì)胞，具有取材方便、低免疫原性、無(wú)倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新型種子細(xì)胞。眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床前期研究表明，臍血MSC作為新型種子細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的優(yōu)勢(shì)明顯，可用于下列多種疾病的治療：(1)脊髓損傷性疾病，脊髓損傷后主要導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者今后生存質(zhì)量，目前藥物治療更多只是延緩損傷進(jìn)展，修復(fù)作用有限，而臍血MSC通過(guò)移植入脊髓受損部位后能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生與存活[21]，并聯(lián)合細(xì)胞替代作用實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)，另有研究表明在脊髓損傷急性期移植臍血MSC對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)更加有利[22]；(2)神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森和阿爾茨海默病等，主要是由神經(jīng)元丟失、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)所致[23-24]，目前可用于治療的藥物少且療效有限，而臍血MSC具有細(xì)胞替代以及減少氧化應(yīng)激的作用[25]，能夠有效解決這些問(wèn)題，成為治療神經(jīng)退行性疾病的新方法；(3)小兒腦性癱瘓，它是一種嚴(yán)重阻礙患兒智能和運(yùn)動(dòng)發(fā)育的疾病，給家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前治療主要是依靠康復(fù)訓(xùn)練來(lái)改善癥狀，耗費(fèi)人力物力財(cái)力，而臍血MSC移植療法則具有花費(fèi)低、效果顯著的優(yōu)點(diǎn)[26]，是目前腦癱治療的研究熱點(diǎn)；(4)腦卒中，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，以后者為主，已成為我國(guó)第一位死亡原因，且致殘率極高，目前藥物治療大多僅起到預(yù)防保護(hù)作用，而臍血MSC在移植后能夠向腦受損部位遷移，通過(guò)促進(jìn)血管再生改善缺血損傷部位的血流量[27]，以減少梗死面積，并通過(guò)細(xì)胞替代修復(fù)受損神經(jīng)，修復(fù)效果可靠。除上述疾病外，臍血MSC還可用于缺血缺氧性腦損傷、脊髓側(cè)索硬化癥、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，應(yīng)用前景廣泛。

雖然臍血MSC的應(yīng)用具有很多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在以下問(wèn)題：(1)體外培養(yǎng)問(wèn)題，臨床應(yīng)用需要大量細(xì)胞，如何保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下穩(wěn)定高效擴(kuò)增，并避免在高速擴(kuò)增過(guò)程中細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化；(2)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)問(wèn)題，臍血MSC的多向分化潛能隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)以及所傳代數(shù)的增多而降低[28]，另外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)會(huì)增加細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)換的概率，應(yīng)注意實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；(3)誘導(dǎo)分化問(wèn)題，如何合理選擇誘導(dǎo)劑，如何安全高效誘導(dǎo)臍血MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化，目前尚未有統(tǒng)一的意見(jiàn)和方法；(4)臨床應(yīng)用安全性問(wèn)題，雖有研究表明MSC體內(nèi)移植后的致瘤潛能很低[29]，但仍需謹(jǐn)慎，且在體內(nèi)移植之前需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格測(cè)驗(yàn)，如細(xì)胞活力以及內(nèi)毒素檢測(cè)，否則可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良后果。

綜上所述，雖然臍血MSC已被證明是一種非常有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞，但是在大量臨床應(yīng)用之前，需要更深入的研究。相信隨著對(duì)臍血MSC研究的不斷深入，這些問(wèn)題終會(huì)得到解決，屆時(shí)，臍血MSC將會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。