柏 青，黃尤光，李 涓，邢小芳，李順序，黃 晶，王永梅

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)當(dāng)前在臨床上比較常見(jiàn)，占反復(fù)流產(chǎn)的50%左右[1]。該病是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥3次自然流產(chǎn)，且不存在解剖、內(nèi)分泌、染色體和自身免疫功能異常以及生殖道感染等病因[2-3]。目前其具體的發(fā)病機(jī)制還不明確，導(dǎo)致治療效果不佳。胎盤(pán)絨毛血管的協(xié)調(diào)發(fā)育與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)，多數(shù)流產(chǎn)產(chǎn)婦存在絨毛血管發(fā)育異常，表現(xiàn)為絨毛毛細(xì)血管數(shù)目減少或功能障礙[4-5]?，F(xiàn)代研究表明，胎盤(pán)內(nèi)皮增生過(guò)程中，血管機(jī)能不全可能是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因之一。缺氧對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)的侵襲和分化過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用，妊娠過(guò)程中的胎盤(pán)發(fā)生是在相對(duì)缺氧的環(huán)境中進(jìn)行的，推測(cè)氧信號(hào)調(diào)節(jié)通路可能在流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用[6-7]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧時(shí)，能夠激活缺氧信號(hào)通路，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，參與多種與血管形成有關(guān)的疾病[8-11]。本研究探討了HIF-1α信號(hào)通路參與胎盤(pán)內(nèi)皮增生的可能機(jī)制，希望有利于闡述不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 （1）觀(guān)察組：選擇2014年 2月～2018年2月在醫(yī)院診治的不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)產(chǎn)婦78例，納入標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方染色體檢查正常；近3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)甾體類(lèi)激素；連續(xù)自然流產(chǎn)＞3次，宮頸分泌物檢測(cè)支原體、衣原體為陰性；性激素和垂體激素正常；精液常規(guī)檢查無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖器有器質(zhì)性病變；出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀且B超檢查提示孕囊無(wú)原始心血箭搏動(dòng)；孕周≤12 w。（2）對(duì)照組：另選擇同期在本院門(mén)診行人工流產(chǎn)術(shù)產(chǎn)婦78例，納入標(biāo)準(zhǔn)：有至少一次的正常妊娠史，既往無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)及早產(chǎn)等異常孕育史；月經(jīng)周期28～30 d，月經(jīng)規(guī)律，量、色均正常；B超檢查提示胚胎發(fā)育正常；無(wú)先兆流產(chǎn)癥狀；排除感染及染色體、內(nèi)分泌、自身免疫異常等疾病。

兩組一般資料比較無(wú)顯著差異(P＞0.05，表1)。本研究得到了所有產(chǎn)婦的知情同意，醫(yī)院倫理委員會(huì)也批準(zhǔn)了此次研究。

1.2 胎盤(pán)絨毛標(biāo)本采集 胎盤(pán)娩出后，立即取胎盤(pán)母面中央絨毛組織塊約1 cm×1 cm×1 cm，漂洗后，用10%中性福爾馬林溶液固定≥24 h，梯度酒精脫水后石蠟包埋，采用5 μm連續(xù)切片，4℃保存。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 樣本采用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，修復(fù)抗原。PBS液洗×3次，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清室溫孵育10 min，除非特異性染色。滴加濃度為1∶100兔抗人單克隆抗體VEGF、HIF-1α(一抗)，4 ℃過(guò)夜。PBS 液洗×3 次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育15 min。PBS液洗×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液(酶標(biāo)鏈親和素)，37℃孵育 15 min。PBS液洗×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。以PBS替代第一抗體作為陰性對(duì)照，VEGF、HIF-1α蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿及胞膜，部分可見(jiàn)細(xì)胞核著色，為淺黃至棕色顆粒，每例標(biāo)本在400倍光鏡下隨意選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)求為陽(yáng)性百分率，積分 0～1 分為(－)；2～3 分為(+)；4～5 分為(++)；＞5分為(+++)，陽(yáng)性率=[(++)+(+++)]例數(shù)/總例數(shù)×100%。將切片置于40倍顯微鏡下，確定染色最高血管密度區(qū)域；然后置于200倍顯微鏡下，選擇3個(gè)最高血管密度區(qū)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，求其平均值作為該患者的微血管密度(MVD)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.00統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分率表示，組間比較分別行t檢驗(yàn)或χ2分析；相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率比較 觀(guān)察組VEGF和HIF-1α陽(yáng)性率都低于對(duì)照組(P＜0.05，表2)。

2.2 MVD密度比較 觀(guān)察組MVD密度為(27.49±5.19)%，顯著低于對(duì)照組(39.58±4.59)%(P＜0.01)。

2.3 相關(guān)性分析 觀(guān)察組中，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，MVD與VEGF、HIF-1α陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，VEGF與HIF-1α陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表1 兩組一般資料比較(n=78)

表2 兩組VEGF和HIF-1α陽(yáng)性率比較(n=78,%)

表3 觀(guān)察組相關(guān)性結(jié)果(r,n=78)

3 討論

成功的妊娠取決于良好的胎盤(pán)生長(zhǎng)和發(fā)育，包括胚胎形成、胎兒發(fā)育及其與母體內(nèi)適應(yīng)性改變[12]。胎兒發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)全部來(lái)自于胎盤(pán)，胎盤(pán)內(nèi)皮增生和功能調(diào)節(jié)是保證胎兒從母體獲得充足氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵，因此，胎盤(pán)的形成是妊娠成功的關(guān)鍵[13]。相關(guān)研究表明，妊娠早期胎盤(pán)發(fā)育是在相對(duì)缺氧的環(huán)境中，胎盤(pán)局部氧感受和信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)對(duì)胎盤(pán)內(nèi)皮增生發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。HIF-1能轉(zhuǎn)錄活性核蛋白，主要參與調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)。VEGF為一種同型二聚體糖蛋白，在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合生長(zhǎng)因子受體，促進(jìn)血管的再生，對(duì)維持血管的正常形態(tài)和功能有積極作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，觀(guān)察組VEGF和HIF-1α陽(yáng)性率都低于對(duì)照組，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示VEGF與HIF-1α陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)可能與VEGF與HIF-1α的低表達(dá)有關(guān)。從機(jī)制上分析，HIF-1α可上調(diào)VEGF相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管增生，適應(yīng)缺氧[17]。在缺氧時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生HIF-1α，誘導(dǎo)VEGF和一些糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)，使血管增生，增加供氧、供血和能量，改善缺氧環(huán)境[18-19]。HIF-1α可廣泛參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異應(yīng)答，調(diào)控多種基因的缺氧誘導(dǎo)表達(dá)，機(jī)體對(duì)缺氧產(chǎn)生適應(yīng)。如果HIF-1α低表達(dá)，下游靶基因的調(diào)控活性會(huì)下降，胎盤(pán)增生出現(xiàn)障礙，滋養(yǎng)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換障礙，影響胎盤(pán)正常功能的發(fā)揮，HIF-1α調(diào)節(jié)VEGF過(guò)程出現(xiàn)障礙，胎盤(pán)內(nèi)皮不良增生，影響胚胎著床及早期發(fā)育，從而導(dǎo)致不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀(guān)察組胎盤(pán)絨毛組織的MVD密度低于對(duì)照組，表明不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)可能與胎盤(pán)絨毛組織的微血管密度低有關(guān)。從機(jī)制上分析，胎盤(pán)微血管發(fā)育不良及血管密度減少，造成母體與胎兒血氧等物質(zhì)交換障礙，胎盤(pán)發(fā)育受阻而導(dǎo)致流產(chǎn)，表明MVD減少是造成流產(chǎn)的的原因之一[20]。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，觀(guān)察組的MVD密度與VEGF、HIF-1α陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)性，提示反復(fù)自然流產(chǎn)孕婦胎盤(pán)組織MVD密度降低可能是由VEGF、HIF-1α低表達(dá)引起的。人體早期的胎盤(pán)內(nèi)皮增生是發(fā)生在一個(gè)相對(duì)缺氧的環(huán)境中，其增生發(fā)育經(jīng)歷了一個(gè)氧濃度從低到高的梯度變化過(guò)程，氧濃度的變化可能是滋養(yǎng)細(xì)胞分化及胎盤(pán)血管網(wǎng)形成過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素。氧濃度較低時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始增殖；氧濃度較高時(shí)，分化侵襲表型的滋養(yǎng)細(xì)胞，慢慢浸潤(rùn)到子宮內(nèi)膜，使血管再生，為胎兒提供發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)[21]。本研究表明，絨毛組織中VEGF與HIF-1α的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換障礙、血管生成受阻、血管密度減少，從而引起血管重鑄障礙，胎盤(pán)灌注不足引起流產(chǎn)。

總之，胎盤(pán)內(nèi)皮增生是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，HIF-1α信號(hào)通路可能參與胎盤(pán)內(nèi)皮增生過(guò)程，其低表達(dá)可能與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。