張 棋，舒佳惠，歐陽夢琪，王慶松

慢性腦低灌注（CCH）是缺血性腦損害的重要病理生理基礎(chǔ)，也是引發(fā)血管性認(rèn)知障礙等卒中后神經(jīng)血管功能障礙的常見危險(xiǎn)因素和病理生理機(jī)制[1-2]。腦血管病相關(guān)消化道癥狀臨床常見，半數(shù)以上卒中患者可出現(xiàn)吞咽困難、潰瘍、便秘或胃腸道出血等并發(fā)癥[3]；另一方面，腸道作為應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一，腸黏膜屏障及腸道功能改變在神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)調(diào)控、機(jī)體功能維持中有重要意義[4-5]。雖然研究顯示腦血管病后急性期存在腸屏障損傷、腸通透性增加及緊密連接蛋白表達(dá)減少等病理生理變化[6]，但有關(guān)急性缺血性腦損害后CCH狀態(tài)對腸黏膜的持續(xù)性損害效應(yīng)目前尚未見報(bào)道，而進(jìn)一步探討CCH所致腸黏膜屏障及功能改變，有助于深入認(rèn)識卒中相關(guān)神經(jīng)血管功能障礙的相關(guān)機(jī)制、探尋有效防護(hù)措施。因此，本研究擬探討CCH致大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)改變及緊密連接蛋白claudin-3表達(dá)變化及其相關(guān)性，初步揭示CCH對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸黏膜屏障及功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠 80 只[清潔級，體重（260±20）g]，購自成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號：SCXK（川）2015-030。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為Sham組（32只）和CCH組（48只）。

1.2 CCH模型制備 在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法（BCCAO）建立CCH模型[7]。Sham組方法同前，但雙側(cè)頸總動(dòng)脈只分離而不結(jié)扎。造模后，Sham組大鼠無死亡，CCH組死亡10只。各組再按照觀察時(shí)間不同分為如下亞組：（1）Sham 1 w 組（n=8）；（2）Sham 4 w 組（n=8）；（3）Sham 12 w 組（n=8；（4）Sham 24 w 組（n=8）；（5）CCH 1 w組（n=10）；（6）CCH 4 w 組（n=9）；（7）CCH 12 w 組（n=10）；（8）CCH 24 w 組（n=9）。

1.3 腸組織標(biāo)本的制備 各亞組在CCH建模后相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，麻醉大鼠，沿腹中線剪開，距回盲部5 cm處取回腸末段組織（長度1 cm），生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定（24 h），制成厚度4 μm的石蠟標(biāo)本、切片，用于HE染色及免疫熒光染色。

1.4 HE染色 腸標(biāo)本切片脫蠟后，蘇木精染色，分色后伊紅染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，Chiu腸黏膜損傷評分法進(jìn)行病理損傷評估[8]。

1.5 免疫熒光染色觀察claudin-3 腸標(biāo)本切片脫蠟后，使用枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0）抗原修復(fù)；封閉 30 min后，直接滴加兔抗 claudin-3抗體（1∶100，ab15102，英國Abcam公司），4℃孵育過夜；PBS漂洗 5 min×3 次；滴加二抗（1:1000，美國 Invitrogen 公司），37 ℃恒溫箱孵育 1 h；PBS漂洗 5 min×3次；DAPI室溫染色5 min，PBS漂洗5 min×3次后封片。使用熒光顯微鏡結(jié)觀察及圖像采集，并使用Image J進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 回腸組織形態(tài)學(xué)變化 Sham組可見回腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛呈指狀且排列較整齊。而CCH組1 w時(shí)回腸絨毛變粗變鈍；隨時(shí)間延長，4 w、12 w時(shí)，黏膜下間隙擴(kuò)大，絨毛頂端部分脫落；24 w時(shí)，腸絨毛縮短且增粗明顯，固有層及其血管暴露（圖1）。按照Chiu腸黏膜損傷評分，CCH組回腸黏膜較同時(shí)間 Sham組損傷明顯（P＜0.01），CCH組中，4 w、12 w及24 w 3個(gè)亞組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但較1 w時(shí)損傷顯著加重（P＜0.01，表1）。

2.2 claudin-3免疫熒光染色結(jié)果 claudin-3完整分布于Sham組回腸黏膜上皮細(xì)胞間隙，CCH組上皮細(xì)胞間claudin-3明顯缺失（P＜0.01），1 w時(shí)最顯著，隨時(shí)間延長，CCH組claudin-3表達(dá)量逐漸升高，但均較同時(shí)間Sham組顯著減少（P＜0.01，表2）。

2.3 腸黏膜損傷程度與claudin-3表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)大鼠回腸黏膜損傷程度與claudin-3表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.819,P＜0.05）。

圖1 各組回腸黏膜組織HE染色結(jié)果(100×)

表1 兩組不同時(shí)間回腸黏膜HE染色Chiu評分比較

3 討論

卒中會引起免疫抑制，導(dǎo)致腸屏障的破壞，影響腸道蠕動(dòng)和滲透性，使機(jī)體易受細(xì)菌感染[9]，這可能與腸黏膜屏障完整性破壞密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CCH組回腸黏膜存在明顯損傷，CCH后1 w腸絨毛開始變粗變鈍，隨后損傷加重，表明CCH可導(dǎo)致持續(xù)的腸黏膜損傷，4 w時(shí)最明顯，此后損傷不繼續(xù)加重，但持續(xù)長達(dá)至少24 w。Tascilar等[10]研究表明，急性缺血性卒中導(dǎo)致腸黏膜絨毛損傷、細(xì)菌移位，提示急性缺血性腦損害后的CCH狀態(tài)對腸黏膜的長時(shí)間持續(xù)性損傷可能會造成腸道通透性增加，誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)及細(xì)菌移位，使機(jī)體其他組織系統(tǒng)易受感染而加重病情。

表2 兩組不同時(shí)間回腸黏膜熒光染色平均光密度比較

各種應(yīng)激發(fā)生時(shí)，胃腸道最早發(fā)生缺血，易較早受損或衰竭，又最后得到恢復(fù)[11]，其中胃腸道黏膜屏障最易受到損傷。腸黏膜屏障能防止腸道內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素進(jìn)入生物體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)系統(tǒng)，而完整的腸黏膜機(jī)械屏障是其發(fā)揮保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接作為腸黏膜機(jī)械屏障的重要組成部分，以細(xì)胞-細(xì)胞黏附的方式連接腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)揮屏障作用[12]。Claudins家族是緊密連接最重要的蛋白質(zhì)，claudin-3在人和大鼠的腸上皮連接處高度表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，CCH組claudin-3的表達(dá)顯著減少（P＜0.01），CCH后1 w時(shí)claudin-3表達(dá)減少最顯著，4 w、12 w后有所回升，24 w時(shí)較1 w雖明顯回升（P＜0.05），但仍低于同時(shí)間Sham組（P＜0.01），提示CCH可致長時(shí)間腸黏膜claudin-3表達(dá)減少，與Lu等[13]的研究結(jié)果一致，可能與腸黏膜的損傷有密切關(guān)系。相關(guān)性分析也顯示，回腸黏膜損傷程度與claudin-3表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示claudin-3可能被用作CCH引發(fā)的腸黏膜損傷標(biāo)志物[14]。

綜上所述，CCH可引發(fā)大鼠回腸黏膜長達(dá)24 w的持續(xù)性損害，腸黏膜claudin-3表達(dá)明顯減少，且腸黏膜損傷程度與claudin-3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示claudin-3表達(dá)水平或可成為CCH致腸黏膜損傷的重要病理標(biāo)志。