■余登航 常家智 董桂芳

(武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023)

腸道炎癥反應(yīng)是高密度集約化養(yǎng)殖魚類常見的疾病癥狀，常給養(yǎng)魚造成巨大的損失，該疾病主要是由病原菌感染所引發(fā)[1-3]。此外，飼料中的營養(yǎng)成分，如豆粕也可以導(dǎo)致魚類腸道炎癥反應(yīng)[4-6]。腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生以后，輕微者可引起魚類行動緩慢，食欲不振，影響魚類正常生長；嚴(yán)重者則引起魚類腹部腫脹，腸道充血，引起魚類大量死亡。

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸（含有共軛雙鍵）的一類空間位置和幾何異構(gòu)體的總稱，主要有cis-9,trans-11CLA（c9t11-CLA）和 trans-10，cis-12CLA（t10c12-CLA）兩種異構(gòu)體。研究表明，在人類、小鼠和豬等哺乳動物中，CLA在活體和細(xì)胞水平都具有抗炎作用[7]。目前為止，關(guān)于CLA對草魚腸道炎癥調(diào)控作用的報道很少。因此，本論文擬通過在草魚飼料中添加適量的共軛亞油酸，探討其對草魚腸道炎癥的調(diào)控作用，為草魚飼料配方的優(yōu)化升級提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表1，參照本課題組前期研究結(jié)果[8]，在基礎(chǔ)飼料中用2%的共軛亞油酸（青島奧海生物有限公司，43.8%c9t11-CLA和47.3%t10c12-CLA）替代等量豆油配制試驗飼料（CLA組）。手工將飼料原料混合均勻，制成直徑2.0 mm的顆粒飼料，45℃的恒溫干燥，使飼料水分含量小于10%，然后-20℃保存待使用。

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)

試驗草魚購于武漢市柏泉農(nóng)場草魚養(yǎng)殖基地，并在武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所的養(yǎng)殖基地中完成養(yǎng)殖試驗。試驗分為三個組（陽性對照組、陰性對照組及CLA組），其中陽性對照組和陰性對照組用對照組飼料投喂，CLA組草魚使用試驗組飼料喂養(yǎng)，將試驗魚養(yǎng)殖在網(wǎng)箱中，每個網(wǎng)箱隨機(jī)分配30尾草魚（7 g/尾左右），每個試驗組有三個重復(fù)，共計9個網(wǎng)箱。養(yǎng)殖周期為35 d，養(yǎng)殖周期內(nèi)，水溫為25～30℃，pH值約為8，溶氧約為7.7 mg/l。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(%干物質(zhì))

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖第28 d，將草魚在MS-222溶液（濃度為60 mg/l）中浸泡10 min麻醉后，根據(jù)趙杰等[9]的描述的方法誘導(dǎo)草魚腸道炎癥。具體操作如下：用注射器插入肛門上端3 cm進(jìn)行注射，CLA組和陽性對照組（TNBS組）注射0.05 ml三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇混合溶液(濃度為2.5%)，陰性對照組(PSS組)注射等體積的0.7%生理鹽水(PSS)。于注射后24 h后，隨機(jī)選取6尾草魚并分離后腸，勻漿離心后測定炎性損傷相關(guān)指標(biāo)，細(xì)胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α的含量用商品試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司）測定，髓過氧化物酶（MPO）的活性用商品試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。剩下的魚于注射后第1、3、7 d觀察、解剖并記錄魚體運(yùn)動，體表損傷以及腸道損傷情況，具體評判標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 肛門灌注TNBS后草魚大體形態(tài)與組織損傷評分[9]

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件包(SPSS，Michigan Avenue，Chicago，IL，USA)進(jìn)行方差分析，用Tukey’s單因素方差分析法檢驗組間差異，P＜0.05表示有顯著性差異，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 魚體運(yùn)動、體表損傷以及腸道損傷情況

由圖1可見，注射TNBS 24 h后，TNBS組魚體出現(xiàn)體表充血嚴(yán)重及鱗片脫落等癥狀；CLA組僅出現(xiàn)肛門充血；PSS組則表現(xiàn)正常。

由表3可見，肛門注射TNBS后各組草魚均出現(xiàn)臨床癥狀，癥狀于第3 d最為嚴(yán)重，隨后于第7 d緩解。與對照組相比，飼料中添加CLA可以緩解TNBS誘導(dǎo)的草魚損傷的臨床癥狀。

圖1 TNBS誘導(dǎo)腸道炎癥24 h后各試驗組體表損傷情況

表3 CLA對TNBS誘導(dǎo)的草魚炎性損傷臨床癥狀影響(評分)

2.2 各組腸道炎癥相關(guān)指標(biāo)

試驗結(jié)果表明，飼料中2%CLA可顯著降低TNBS誘導(dǎo)的腸道炎性細(xì)胞激活的標(biāo)志——髓過氧化物酶（MPO）的活性（圖2）以及炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-8和 TNF-α）的含量（圖3）。

圖2 注射TNBS 24 h后草魚腸道組織MPO活性

圖3 注射TNBS 24 h后草魚腸道組織炎性細(xì)胞因子含量

3 討論

長期以來，有關(guān)CLA在魚類上的研究多集中在CLA對魚類的攝食、生長和組織CLA沉積等營養(yǎng)生理的影響[10]以及組織脂肪代謝的影響[11]，而對CLA在魚類中發(fā)揮抗炎功效的報道很少。本文發(fā)現(xiàn)CLA對草魚腸道炎癥有一定的調(diào)控效果，這可能與CLA是過氧化物酶體增殖物活化受體PPARγ的天然配體有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在草魚飼料中，隨著CLA添加水平升高，草魚腸道中PPARγ基因表達(dá)量顯著提高，CLA含量為2%時PPARγ基因表達(dá)量達(dá)到最大值，且并未對草魚生長造成不良影響[8]。

炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄因子核因子NF-κB調(diào)節(jié)下啟動的[12]，活化的NF-κB從胞漿轉(zhuǎn)位到胞核，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄[13]。在魚類上的研究也同樣表明NF-κB在炎性細(xì)胞因子（如IL-1β和TNF-α）的基因的表達(dá)中起到核心調(diào)節(jié)作用[14]。在細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時中，NF-κB與抑制因子（IκB）結(jié)合以無活性形式存于細(xì)胞質(zhì)。在炎癥反應(yīng)中，IκB激酶（IKK）促使IκB磷酸化，導(dǎo)致NF-κB與IκB解離。解離的NF-κB在核內(nèi)與DNA特定的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄[15]。PPARγ被CLA激活后可以抑制NF-κB的活性從而抑制調(diào)控炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)，其作用機(jī)制與NF-κB抑制因子IκB相似[16-17]。

研究表明，CLA可以通過激活PPARγ途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Yu等[18]使用CLA處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CLA異構(gòu)體混合物能降低細(xì)胞因子如IL-1和IL-6的生成，認(rèn)為CLA具有抗炎癥反應(yīng)至少是部分依賴于過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的調(diào)節(jié)，Yang等[19]也發(fā)現(xiàn)cis-9,trans-11 CLA具有類似的作用。Bassaganya-Riera等[20]的研究表明，CLA可以通過激活豬結(jié)腸PPARγ降低炎性因子TNF-α的產(chǎn)生，從而調(diào)控結(jié)腸炎的發(fā)作時間及損傷程度。

4 結(jié)論

飼料中添加2%共軛亞油酸可以有效調(diào)節(jié)草魚腸道炎癥，這可能與PPARγ被激活有關(guān)。