■孫 皓 戴 煒 周響艷 戰(zhàn)曉燕 張 濤 葉 慧 董澤敏 馮定遠(yuǎn)*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海201699；3.贏創(chuàng)德固賽(中國(guó))投資有限公司，北京 100600）

近年來(lái)，隨著畜禽業(yè)的迅猛發(fā)展，玉米作為主要的能量飼料，價(jià)格持續(xù)走高。而我國(guó)小麥資源豐富，價(jià)格比玉米低，其蛋白質(zhì)、煙酸、賴(lài)氨酸等含量比玉米高，因而開(kāi)發(fā)小麥飼糧具有一定的現(xiàn)實(shí)意義和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而小麥中含有大量非淀粉多糖（nonstarch polysaccharides，NSP），單胃動(dòng)物消化道內(nèi)缺乏消化這類(lèi)多糖的內(nèi)源酶，故這些物質(zhì)不能被有效消化利用[1-2]。因此促進(jìn)小麥中非淀粉多糖的降解成為一個(gè)研究方向。已有研究表明，在小麥飼糧中添加以木聚糖酶為主的NSP酶制劑，可以消除NSP的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高小麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物生產(chǎn)性能[3-5]，因此飼料用酶制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用已成為現(xiàn)代飼料工業(yè)和現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)不可缺少的重要組成部分，而酶制劑正確合理地使用，可以有效緩解飼料資源緊缺的現(xiàn)狀。本試驗(yàn)在小麥型飼糧中添加不同復(fù)合酶制劑（復(fù)合酶組成為：木聚糖酶、β-葡聚糖酶），研究其對(duì)黃羽肉仔雞生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分代謝率和盲腸微生物的影響，探討復(fù)合酶制劑對(duì)肉仔雞的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，以期為肉仔雞養(yǎng)殖過(guò)程中合理有效地利用復(fù)合酶制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)復(fù)合酶由溢多利酶制劑公司技術(shù)研發(fā)部提供，主要由木聚糖酶、β-葡聚糖酶等組成，其中復(fù)合酶A中木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力分別為15 000 U/g和2 000 U/g；復(fù)合酶B中木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力分別為10 000 U/g和1 000 U/g。

1.2 試驗(yàn)日糧

飼養(yǎng)試驗(yàn)飼糧參考NRC（1994）肉雞的營(yíng)養(yǎng)需要，并結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)飼糧組成標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇1日齡的健康黃羽肉雛雞（雄性）1 440只，隨機(jī)分成4個(gè)處理組（見(jiàn)表2），每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只。飼養(yǎng)試驗(yàn)持續(xù)21 d。

表2 試驗(yàn)分組情況

2 測(cè)定指標(biāo)與方法

2.1 肉雞生長(zhǎng)性能

記錄試驗(yàn)前體重，每天觀(guān)察雞的健康狀況，每周稱(chēng)量雞的活體重和余料重量，統(tǒng)計(jì)肉仔雞的平均日采食量、平均日增重和料重比。

2.2 代謝試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)分組

采用全收糞法。試驗(yàn)選用60只成年公雞，隨機(jī)分成5組，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。其中一組為內(nèi)源組，其他4組分別為正對(duì)照組、負(fù)對(duì)照組、復(fù)合酶A組、復(fù)合酶B組。用試驗(yàn)飼糧預(yù)飼3 d，然后連續(xù)收集4 d糞樣。糞樣收集后按每100 g鮮樣加10%硫酸5 ml、滴加5滴甲苯防腐，混勻并置于-20℃冰柜中保存，用于干物質(zhì)代謝率、能量代謝率和粗蛋白質(zhì)代謝率測(cè)定。

2.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

飼料、糞樣和食糜的測(cè)定指標(biāo)有干物質(zhì)、總能、粗蛋白質(zhì)和粗纖維；總能、攝入飼料能值、排泄物能值采用燃燒法，用長(zhǎng)沙儀器廠(chǎng)生長(zhǎng)的WGR-1G微電腦煤質(zhì)測(cè)定處理儀測(cè)定；粗蛋白質(zhì)采用凱氏微量定氮法，用FOSS 2300 KJELTEC ANALYZER UNIT自動(dòng)定氮儀測(cè)定。

2.3 屠宰試驗(yàn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后（雞已停料12 h），以重復(fù)為單位，每個(gè)重復(fù)取體重接近平均水平的2只試驗(yàn)雞（共48只）。取腺胃、肌胃（去除內(nèi)容物）、心臟、肝臟和胰臟迅速稱(chēng)其鮮重并計(jì)算內(nèi)臟器官指數(shù)。體表消毒后取整段盲腸，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)臟器官指數(shù)(%)=內(nèi)臟器官鮮重(g)/體重(g)×100

2.4 盲腸微生物區(qū)系

試驗(yàn)時(shí)取盲腸中部約2 cm，截取1 cm用于試驗(yàn)，采用EZgeneTM Bacterial gDNA Kit（Biomiga，USA）試劑盒提取DNA。利用細(xì)菌通用引物（由上海生物工程有限公司合成）擴(kuò)增16S rDNA的V6～V8區(qū)片段。PCR上游引物為帶有GC夾子的U968-GC-f：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’，下游引物(L1401r)：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35循環(huán)；72 ℃10 min，PCR產(chǎn)物采用BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System進(jìn)行DGGE電泳檢測(cè)，并用Bio-Rad公司的Quantity one軟件進(jìn)行分析。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各指標(biāo)差異顯著性分析用One-way ANOVA進(jìn)行分析，用LSD法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 復(fù)合酶對(duì)黃羽肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3 復(fù)合酶對(duì)1～21日齡黃羽肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，1～21日齡時(shí)，復(fù)合酶B組試驗(yàn)雞平均日采食量最低，正對(duì)照組最高，各組間差異不顯著（P＞0.05）；負(fù)對(duì)照組、復(fù)合酶B組試驗(yàn)雞的平均日增重與正對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），復(fù)合酶A組比負(fù)對(duì)照組提高了4.11%，但差異不顯著（P＞0.05）；正對(duì)照組試驗(yàn)雞的料重比最低，負(fù)對(duì)照組最高，負(fù)對(duì)照組、復(fù)合酶B組與正對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），復(fù)合酶A組比負(fù)對(duì)照組降低了2.83%，但差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 復(fù)合酶對(duì)黃羽肉仔雞內(nèi)臟器官發(fā)育的影響(見(jiàn)表4)

由表4可知，1～21日齡，負(fù)對(duì)照組試驗(yàn)雞的心臟重量最低，復(fù)合酶B組最高，復(fù)合酶B組比正對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組分別提高了13.02%、24.03%，差異顯著（P＜0.05），復(fù)合酶A組比負(fù)對(duì)照組提高了22.73%，差異顯著（P＜0.05）；其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。各組間的肝臟、脾臟和腺胃重量差異均不顯著（P＞0.05）。復(fù)合酶B組試驗(yàn)雞的胰腺重量與正對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；其它各組之間差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)合酶A組試驗(yàn)雞肌胃重量比正對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組分別提高了13.88%、18.52%，差異顯著（P＜0.05）；其它各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 復(fù)合酶對(duì)黃羽肉仔雞內(nèi)臟器官重量及指數(shù)的影響

復(fù)合酶A組、復(fù)合酶B組試驗(yàn)雞心臟指數(shù)分別與正對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組均差異顯著（P＜0.05）。正對(duì)照組試驗(yàn)雞的肝臟指數(shù)與負(fù)對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05）。各組之間的脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。復(fù)合酶A組試驗(yàn)雞的肌胃指數(shù)比正對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組分別提高了19.54%、15.24%，差異顯著（P＜0.05），復(fù)合酶B組與正對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。復(fù)合酶B組試驗(yàn)雞的腺胃指數(shù)比正對(duì)照組提高了16.05%，差異顯著（P＜0.05）；其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

3.3 復(fù)合酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝率的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，復(fù)合酶A組、復(fù)合酶B組飼料中干物質(zhì)表觀(guān)消化率比負(fù)對(duì)照組分別提高了3.93%、2.29%，差異不顯著（P＞0.05）；復(fù)合酶A組的粗蛋白質(zhì)真代謝率比負(fù)對(duì)照組提高了47.63%，差異極顯著（P＜0.01），復(fù)合酶B組比負(fù)對(duì)照組提高了21.34%，但差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)合酶A組、復(fù)合酶B組的能量代謝率比負(fù)對(duì)照組分別提高了2.75%、1.55%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表5 復(fù)合酶對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響(%)

3.4 復(fù)合酶對(duì)盲腸微生物的影響（見(jiàn)圖1、圖2）

圖1 盲腸微生物DGGE電泳圖譜

從圖1、圖2中可以看出，樣品經(jīng)過(guò)變性梯度凝膠電泳之后，都可以分離出數(shù)目不等的電泳條帶，各處理組之間至少有3條共同的條帶，即同有菌。另外，加酶組也出現(xiàn)了自己獨(dú)有的條帶，即獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌種。同時(shí)，同一組內(nèi)的三條泳道的條帶的位置和數(shù)目也不相同，說(shuō)明不同雞個(gè)體間腸道微生物菌群也存在一定差異。對(duì)DGGE電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表6，由表6可知，正對(duì)照組試驗(yàn)雞的盲腸微生物DGGE電泳條帶數(shù)目最少，復(fù)合酶B組最多，兩復(fù)合酶組分別比正對(duì)照組提高了14.27%和14.59%，均差異極顯著（P＜0.01）；復(fù)合酶B組比負(fù)對(duì)照組提高了6.72%，差異顯著（P＜0.05）；復(fù)合酶A組比負(fù)對(duì)照組提高了6.43%，有顯著性趨勢(shì)（P=0.06）。

4 討論

4.1 復(fù)合酶對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

非淀粉多糖根據(jù)水溶性分為不溶性非淀粉多糖（insoluble non-starch polysaccharides，INSP）和水溶性非 淀 粉 多 糖（soluble non-starch polysaccharides，SNSP）。無(wú)論INSP還是SNSP對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的都有極大的影響，主要體現(xiàn)在阻礙飼料原料細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放，抵制消化酶活性和增加食糜黏度[6]。研究表明，飼糧中添加NSP酶制劑可以有效破壞NSP的結(jié)構(gòu)，從而降低NSP抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[7-8]。本試驗(yàn)中，負(fù)對(duì)照組比正對(duì)照組能量降低了0.61 MJ/kg（降低了5%），在負(fù)對(duì)照組飼糧中添加復(fù)合酶不同程度地提高了黃羽肉仔雞的生長(zhǎng)性能，與前人通過(guò)添加復(fù)合酶提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能結(jié)果一致[7]。

圖2 盲腸微生物DGGE電泳條帶示意圖

表6 復(fù)合酶對(duì)盲腸微生物DGGE電泳條帶的影響

4.2 復(fù)合酶對(duì)內(nèi)臟器官發(fā)育的影響

飼糧的營(yíng)養(yǎng)狀況會(huì)直接影響雞的體型參數(shù)和內(nèi)臟器官的發(fā)育，而內(nèi)臟器官的發(fā)育情況會(huì)直接影響到雞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、體重的增加以及屠宰性狀的改善。NSP溶解使腸道食糜黏度和體積增加，刺激消化腺的增生以增加消化酶的分泌量，動(dòng)物機(jī)體作出代償性的生理反應(yīng)，增加消化器官的負(fù)擔(dān)導(dǎo)致動(dòng)物胰臟、肝臟的增大。Ikegami等[9]表明，長(zhǎng)期飼喂含NSP的日糧可增加消化液的分泌，使消化器官代償性增大。日糧中添加酶制劑后可以消除NSP所帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)，改善內(nèi)臟器官的發(fā)育。王金全[7]報(bào)道，與小麥基礎(chǔ)飼糧組相比，添加木聚糖酶后胰臟相對(duì)重量降低13%，其它消化器官相對(duì)重量有降低趨勢(shì)但差異不顯著。本試驗(yàn)中，加酶組比正常飼糧降低了0.61 MJ/kg的能量，并且添加了小麥22.34%和小麥麩7.52%，從而增加飼糧粗纖維含量，但是從試驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，大多數(shù)內(nèi)臟器官重和器官指數(shù)與正負(fù)對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05），并且加酶組的數(shù)值大部分都在負(fù)對(duì)照組與正對(duì)照組之間，比負(fù)對(duì)照組效果要好，但比正對(duì)照組效果稍微差一點(diǎn)，說(shuō)明加酶能改善非常規(guī)飼料（小麥、小麥麩）的營(yíng)養(yǎng)，小麥+復(fù)合酶能部分替代玉米。其中復(fù)合酶A組比復(fù)合酶B組的效果要好。

4.3 復(fù)合酶對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響

研究表明，復(fù)合酶能提高飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝率，原因可能在于酶制劑對(duì)飼糧中抗?fàn)I養(yǎng)因子的破壞作用[10-12]。玉米、豆粕、菜籽粕、小麥等常用植物性飼料原料細(xì)胞壁中NSP含量均較高，復(fù)合酶制劑中所含的NSP酶能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞壁崩解，使細(xì)胞壁包裹的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分釋放出來(lái)，與畜禽腸道內(nèi)的消化酶充分接觸，從而提高各種養(yǎng)分的消化率。同時(shí)，酶制劑能消除SNSP對(duì)內(nèi)源性消化酶的抑制作用。有研究報(bào)道SNSP可抑制消化道中淀粉酶、二糖酶和脂肪酶的活性。本次試驗(yàn)，兩組復(fù)合酶制劑對(duì)干物質(zhì)表觀(guān)消化率、粗蛋白質(zhì)真代謝率、能量代謝率都有不同程度的提高，其中復(fù)合酶A組的效果要好于復(fù)合酶B組，復(fù)合酶A組的粗蛋白質(zhì)真代謝率比負(fù)對(duì)照組提高了47.63%，差異極顯著（P＜0.01），其它的均差異不顯著。這有可能是因酶制劑種類(lèi)和數(shù)量以及做代謝試驗(yàn)的動(dòng)物有差異所造成的試驗(yàn)結(jié)果不一致。

4.4 復(fù)合酶對(duì)盲腸微生物區(qū)系的影響

動(dòng)物腸道微生物復(fù)雜多樣，形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)其生長(zhǎng)和健康起著非常重要的作用。NSP可以通過(guò)腸道微生物間接發(fā)揮其抗?fàn)I養(yǎng)作用。NSP抑制了養(yǎng)分的消化和吸收，未能在小腸內(nèi)消化和吸收的養(yǎng)分進(jìn)入到后腸道，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在后腸道內(nèi)的蓄積，溫暖濕潤(rùn)富含養(yǎng)分的食糜是細(xì)菌特別是致病菌理想的培養(yǎng)基，利于細(xì)菌的大量繁殖；高黏度的食糜通過(guò)消化道的速度降低，菌群移動(dòng)減慢，為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境。此外，高黏度的食糜使消化道內(nèi)的氧氣減少，利于厭氧微生物的生長(zhǎng)，細(xì)菌大量繁殖并刺激腸道，增厚腸道黏膜，損害微絨毛，加劇宿主和細(xì)菌之間的競(jìng)爭(zhēng)[13]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法一般采用選擇性培養(yǎng)基通過(guò)倍比稀釋及菌落計(jì)數(shù)，將各種菌分離和鑒定。它可在菌株水平測(cè)定活菌含量，較直觀(guān)，計(jì)數(shù)簡(jiǎn)單，方便實(shí)用，但只能研究比較容易培養(yǎng)的微生物。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于16S rRNA、18S rRNA分子技術(shù)促進(jìn)了動(dòng)物體內(nèi)微生物研究的發(fā)展，尤其是被稱(chēng)為DNA指紋技術(shù)的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）研究微生物多樣性以來(lái)，受到越來(lái)越多科學(xué)工作者的關(guān)注。變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)是一種利用不同DNA片段解鏈特性和梯度變性膠（由尿素和甲酰胺組成的變性劑的濃度不同）的特性，在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)將不同DNA片段分離開(kāi)來(lái)的系統(tǒng)，可檢測(cè)只有一個(gè)堿基差異的DNA片段。該技術(shù)是最早在醫(yī)學(xué)上用于檢測(cè)基因突變的，近年來(lái)PCRDGGE也開(kāi)始用于腸道菌群的微生態(tài)研究[14-15]。本試驗(yàn)利用該技術(shù)對(duì)小麥型飼糧添加復(fù)合酶制劑對(duì)盲腸菌群變化進(jìn)行了研究。從表6可以看出，兩個(gè)加酶組顯著提高了電泳條帶數(shù)，說(shuō)明了酶制劑的添加影響了腸道菌群的建立，增加了一些優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)。一方面由于添加酶后，致使食糜黏度降低，腸道運(yùn)動(dòng)加速，從而縮短食糜在消化道的停留時(shí)間，防止蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪在腸道的過(guò)度發(fā)酵，使大量病原菌的繁殖條件不能建立而減少了后腸道有害微生物的數(shù)量，增加了一部分有益菌的種類(lèi)和數(shù)量；另一方面可能是酶降解非淀粉多糖成寡糖所引起的，Catala等[16]研究報(bào)道，多數(shù)寡糖對(duì)宿主的保健作用主要是通過(guò)促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。還有一些寡糖還能夠有效清除或減少部分黏附到腸腔的病原菌。另外，同一組內(nèi)的樣本雖然存在共有菌，但組內(nèi)相似性整體不高，都低于85%，說(shuō)明組間個(gè)體間差異較大，并不能?chē)?yán)格反映酶對(duì)其菌群變化的影響，此外，DGGE技術(shù)本身的局限性對(duì)實(shí)驗(yàn)也有一定的影響，DGGE只能檢測(cè)到細(xì)菌總數(shù)超過(guò)1%的菌群[17]，所以樣品中尚有一些細(xì)菌未能充分反映。

5 結(jié)論

①與負(fù)對(duì)照組相比，復(fù)合酶A和復(fù)合酶B均有降低料重比的趨勢(shì)，但沒(méi)有達(dá)到顯著性水平。且復(fù)合酶A組的效果要好于復(fù)合酶B組，復(fù)合酶A組比負(fù)對(duì)照組平均日增重提高了4.11%，料重比降低了2.83%。

②與正對(duì)照組相比，復(fù)合酶A、B均有提高黃羽肉仔雞的心臟、肌胃重量以及心臟、肌胃、腺胃指數(shù)的趨勢(shì)。

③與負(fù)對(duì)照組相比，復(fù)合酶A組極顯著地提高了粗蛋白質(zhì)真代謝率，而且對(duì)干物質(zhì)表觀(guān)消化率和能量代謝率也有不同程度的提高，但不顯著。

④復(fù)合酶A、B可增加黃羽肉仔雞盲腸中一些優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)。