孫昌華 劉 娜 王春芳 張 娟 祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101）

在毒理學(xué)研究中，臨床病理學(xué)是非常重要的一個(gè)分支學(xué)科。它是一門(mén)將臨床醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)對(duì)各種項(xiàng)目的檢驗(yàn)，為藥物毒性的評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)的學(xué)科[1]。臨床檢驗(yàn)的目的是為臨床提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)診斷依據(jù)。為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中必須堅(jiān)持全面質(zhì)量控制（total quality control TQC，即指對(duì)影響臨床檢驗(yàn)結(jié)果可靠性的各方面因素及各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制）和全過(guò)程質(zhì)量控制（即指對(duì)實(shí)驗(yàn)工作的全過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制和質(zhì)量管理）。全過(guò)程質(zhì)量控制包括實(shí)驗(yàn)前（分析前）、實(shí)驗(yàn)中（分析中）和實(shí)驗(yàn)后（分析后）三個(gè)階段的質(zhì)量控制。在實(shí)驗(yàn)誤差中實(shí)驗(yàn)前誤差占70%，因而實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量保證對(duì)減少實(shí)驗(yàn)誤差顯得尤其重要[2]。

待檢測(cè)的血液標(biāo)本的保存是臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分析過(guò)程中，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制的一個(gè)重要組成部分[3]，血液標(biāo)本的具體放置時(shí)間及方式，對(duì)檢測(cè)得到的生化指標(biāo)具體值所產(chǎn)生的影響及其原因是目前臨床醫(yī)學(xué)界所關(guān)注和探討的一個(gè)焦點(diǎn)性課題[4-6]。資料顯示，由于檢驗(yàn)前對(duì)標(biāo)本處理不當(dāng)造成的檢驗(yàn)誤差占總的檢驗(yàn)誤差的60%以上[7-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，血液標(biāo)本的保存方式對(duì)生化項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果具有重要影響[10-11]。在檢驗(yàn)臨床和科研工作中，經(jīng)常要對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行凍存，以備日后檢測(cè)或復(fù)查?！把宸盅b凍融檢測(cè)會(huì)影響結(jié)果”似乎已成為共識(shí)。問(wèn)題是影響程度有多大？導(dǎo)致結(jié)果升高還是降低？本文通過(guò)血清標(biāo)本分裝凍融對(duì)相關(guān)生化檢測(cè)結(jié)果的影響，初步探索了血清檢測(cè)過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)的變化特點(diǎn)，為檢驗(yàn)者提供最佳的檢測(cè)時(shí)間提供參考，用科學(xué)的數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明標(biāo)本前處理對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性影響的重要性。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

7180全自動(dòng)生化分析儀（日本日立）；臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；海信BCD-227uk電冰箱（海信集團(tuán)）

1.2 試劑及耗材

血清生化促凝管（山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司）；一次性使用血樣采集針（山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司）；4.5%戊巴比托納（Sigma公司）；生化復(fù)合校準(zhǔn)品（CFAS），生化質(zhì)控物 Level 1（AMCC），生化質(zhì)控物 Level 2（AMCC），ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG試劑盒（四川邁克生物科技股份有限公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（魯）20140007，雌性 SD大鼠40只，體質(zhì)量280～330 g。

1.4 采集、離心

動(dòng)物麻醉后，腹主動(dòng)脈采集空白組SD大鼠血液，每只動(dòng)物采集1管，每管約6～8 m L，編號(hào)標(biāo)識(shí)，血液2～8℃靜止30 min后離心，血清分裝并用封口膜封口，每只動(dòng)物分裝4份。

1.5 方法

1.5.1 儀器校準(zhǔn)及質(zhì)量控制：儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控按照本實(shí)驗(yàn)室的儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。儀器開(kāi)機(jī)后使用復(fù)合校準(zhǔn)品分別對(duì) ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG九項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)，待校準(zhǔn)結(jié)束后進(jìn)行復(fù)合質(zhì)控品的檢測(cè)。質(zhì)控結(jié)果均在質(zhì)控物靶值范圍內(nèi)方可進(jìn)行檢測(cè)。血清首次檢測(cè)（室溫4 h）應(yīng)對(duì)儀器待檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行校準(zhǔn)，之后-20℃凍存各保存時(shí)間（2 d、7 d、14 d）如質(zhì)控結(jié)果均在質(zhì)控物靶值范圍內(nèi)時(shí)儀器則不進(jìn)行校準(zhǔn)。各保存時(shí)間（2 d、7 d、14 d）的每次檢測(cè)均于檢測(cè)前、檢測(cè)后進(jìn)行2次復(fù)合質(zhì)控品的檢測(cè)。

1.5.2 血清分組和凍融方式：血清標(biāo)本離心，分裝后用封口膜封口，每只動(dòng)物分裝4份。室溫4 h完成第一份血清的檢測(cè)，結(jié)果作為基準(zhǔn)參考水平。其余三份血清放置于-20℃凍存，分別于保存時(shí)間的2 d、7 d、14 d各取一份進(jìn)行檢測(cè)。融化方式為直接將冷凍的血清標(biāo)本取出后放置室溫2 h左右以保證完全融化。

1.5.3 血清檢測(cè)：室溫4 h完成第一次檢測(cè)，結(jié)果作為基準(zhǔn)參考水平。 -20℃凍存的血清分別于保存時(shí)間的2 d、7 d、14 d各取一份進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)完畢后檢測(cè)血清無(wú)需經(jīng)害化處理。比較室溫4 h與-20℃凍存各保存時(shí)間內(nèi)生化檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.5.4 檢測(cè)方法：檢測(cè)操作按照生化分析儀操作規(guī)程及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證所有標(biāo)本在同一環(huán)境條件下、由同一人同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 凍存時(shí)間對(duì)血清外觀的影響

血清在保存過(guò)程中顏色、渾濁度和其他物理性狀，從肉眼觀察未見(jiàn)明顯變化，-20℃凍存條件下各保存時(shí)間內(nèi)不同處理組之間未見(jiàn)明顯區(qū)別。

2.2 凍存時(shí)間對(duì)血清檢測(cè)結(jié)果的影響

見(jiàn)表1。

表1 不同保存條件下各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

表1 不同保存條件下各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

注：*P＜0.05與室溫4 h比較Note：*P＜0.05 compared with Room temperature 4 h

ALT/（U/L） 22±3 20±4* 19±3*21±4 AST/（U/L） 158±34 155±40 139±35 157±37 TP/（g/L） 55.0±2.8 50.4±4.6*48.5±4.6* 51.8±5.4*ALB/（g/L） 33.7±1.5 30.8±2.3*29.5±2.6* 31.3±2.9*GLU/（mmol/L） 7.2±0.7 6.2±1.0*6.1±0.7* 6.3±1.1*UREA/（mmol/L） 6.1±1.1 5.7±0.9 5.5±0.9* 5.7±0.9 CREA/（μmol/L） 26±4 24±3* 21±3* 23±4*TC/（mmol/L） 1.47±0.34 1.35±0.36 1.28±0.34*1.36±0.34 TG/（mmol/L）0.45±0.10 0.42±0.10 0.41±0.12 0.44±0.12

3 討論

藥物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的目的是為了確保人用藥物的安全。血液是藥物作用最常見(jiàn)、最敏感、最大的靶器官，某些藥物直接或間接作用于血液及造血系統(tǒng)，造成可逆或不可逆性的各種復(fù)雜的損傷[12]。2006年我們國(guó)家首部規(guī)范臨床實(shí)驗(yàn)室管理的國(guó)家級(jí)法規(guī)《臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》出臺(tái)，標(biāo)志我們國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室的管理已經(jīng)進(jìn)入了新的階段，臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)ISO15189的國(guó)際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和認(rèn)證的管理需要，都促使臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量問(wèn)題日益成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制主要分為分析前、分析中、分析后，大量的實(shí)驗(yàn)表明[8-9]，臨床實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量問(wèn)題超過(guò)60%以上來(lái)源于分析前，因此，分析前因素的控制就成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保證，而標(biāo)本的正確處理又是分析前因素中最為重要的因素之一[7]。

SD大鼠血清標(biāo)本-20℃凍存條件下分裝凍融檢測(cè)結(jié)果分析可見(jiàn)，分裝凍融14 d血清生化檢測(cè)結(jié)果與室溫4 h比較TP、ALB、GLU、CREA可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；分裝凍融7 d血清生化檢測(cè)結(jié)果與室溫 4 h 比較 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；分裝凍融2 d血清生化檢測(cè)結(jié)果與室溫4 h比較 ALT、TP、ALB、GLU、CREA可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；分裝凍融2 d、7 d、14 d血清生化檢測(cè)結(jié)果與室溫4 h比較 AST、TG均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明，SD大鼠血清標(biāo)本 -20℃分裝凍融條件下2 d、7 d與室溫 4 h比較，7項(xiàng)生化檢測(cè)項(xiàng)目 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)且檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析其原因主要是由于在融凍過(guò)程中一些檢測(cè)指標(biāo)被破壞，即所謂的“冷變性”，造成了凍融后檢測(cè)結(jié)果的偏低，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[13-14]。 -20℃分裝凍融條件下14 d與 2 d、7 d比較，7項(xiàng)生化檢測(cè)項(xiàng)目 ALT、AST、TP、ALB、GLU、TC、TG檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)且部分檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，綜合分析其原因，盡管采取標(biāo)本封蓋、封口膜封口，防止血清標(biāo)本蒸發(fā)等措施，因凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，最終還是影響檢測(cè)結(jié)果，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)致使血清中水分蒸發(fā)加大，血清濃縮，其成分含量相對(duì)增加，檢驗(yàn)結(jié)果升高[5-6，11，15-16]。 本次研究可見(jiàn)，-20℃分裝凍融2 d、7 d、14 d血清生化檢測(cè)結(jié)果與室溫4 h比較AST、TG結(jié)果穩(wěn)定均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6，17-19]。

研究顯示，生化檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)盡早檢測(cè)，盡量降低影響因素[6，11，15，20-21]。 所以，很多血液標(biāo)本需要在采集后3～4 h內(nèi)才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果[22]。研究表明，22～25℃血清或血漿的保存不超過(guò)8 h；8 h內(nèi)不能完成時(shí)，血清或血漿應(yīng)置于2～8℃保存；48 h內(nèi)不能完成的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，或分離的血清或血漿需儲(chǔ)存48 h以上時(shí)，應(yīng)于-20℃保存[2]；如需長(zhǎng)時(shí)間保存后檢測(cè)，最好選擇-80℃冰箱進(jìn)行保存，且以2個(gè)月保存期限檢測(cè)結(jié)果較好[23]，選擇 -80℃要比-20℃更加穩(wěn)定[24-26]。相關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道，標(biāo)本的保存時(shí)間與保存溫度有關(guān)，22～24℃保存2 h，2～4℃保存4 h，-20℃保存2周，-80℃保存6個(gè)月[27]。本研究結(jié)果表明，-20℃分裝凍融條件下SD大鼠血清標(biāo)本對(duì)生化檢測(cè)結(jié)果影響明顯，分裝凍融2 d、7 d因相關(guān)酶所謂的“冷變性”檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；分裝凍融14 d隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，致使血清中水分蒸發(fā)加大，血清濃縮，檢驗(yàn)結(jié)果升高；AST、TG在 -20℃分裝凍融 2 d、7 d、14 d內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與室溫4 h比較，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，未見(jiàn)明顯影響。

綜上所述，待測(cè)血清的保存方式及時(shí)間對(duì)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果具有重要影響，臨床應(yīng)給予高度重視，并根據(jù)各檢測(cè)指示的差異，采取相應(yīng)的保存措施，才能確保保存后的標(biāo)本結(jié)果具有真實(shí)性和可靠性。