邢宇雙 梁啟超 金賁臨 梁憶紅 雷 濤 楊 志 吳宜艷

（1.牡丹江醫(yī)學院藥學院，牡丹江 157011）（2.牡丹江醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，牡丹江 157011）（3.齊齊哈爾醫(yī)學院研究生處，齊齊哈爾161006）

尼古丁、阿片類藥物的濫用、依賴和成癮是亞洲、北美洲、東南歐等許多國家和地區(qū)日益嚴重的社會問題。當前，對尼古丁、嗎啡等藥物成癮后的戒斷治療是學者們研究的熱點問題[1-2]。美國精神病協(xié)會認為尼古丁依賴主要是由于個體反復攝取尼古丁所導致的一種慢性易復發(fā)的綜合癥，這是一類神經(jīng)活性物質(zhì)濫用所致的疾病[3]。尼古丁依賴滿足美國精神疾病診斷標準DSM-Ⅳ中對物質(zhì)依賴的診斷標準，這一診斷標準包括沖動性使用，停藥困難，慢性使用后停藥會產(chǎn)生戒斷癥狀。尼古丁依賴包括軀體依賴和精神依賴。軀體依賴又稱生理依賴，即反復攝入尼古丁，當停止用藥則會發(fā)生一系列癥狀與體征，且令人難以忍受。這些癥狀與體征包括煩躁不安、易怒、焦慮、情緒低落、注意力不集中、失眠、心率降低、食欲增加、抑郁等。精神依賴又稱心理依賴，俗稱心癮，尼古丁的精神依賴表現(xiàn)為對尼古丁的強烈渴求[4]。

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，具有補腎固精、助陽等功效。大量研究表明覆盆子果實中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚類、黃酮、超氧化物歧酶等[5-6]，具有抗衰老、治療泌尿道感染、減肥、抗癌防癌、保護心臟、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等藥理作用[7-13]，但針對覆盆子的抗焦慮作用卻鮮有報道。本實驗研究覆盆子提取物對尼古丁戒斷大鼠焦慮征的作用，并探討其作用機制，為覆盆子的功能開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g：由哈爾濱醫(yī)科大學動物室提供。

1.2 實驗藥品及試劑

覆盆子：購于牡丹江天利醫(yī)藥（經(jīng)生藥學鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子的果實）；尼古?。嘿徲谏虾r代生物科技有限公司；氯化鈉注射液（0.9%）：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司批號 140409F3；磷酸二氫鉀：天津博迪化工股份有限公司批號140606分析純；去甲腎上腺素鹽酸鹽：上?；鶎嵥帢I(yè)有限公司批號 20140513；甲醇：天津市永大化學試劑有限公司批號 20150104色譜純；高氯酸：哈爾濱試劑化工廠批號 20141201分析純；地西泮：天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.3 實驗儀器

高效液相色譜儀LC2103：上海天美科學儀器有限公司 Kromasil 100-5C18 250x4.6 mm；離心機：eppendorf centrifuge 5424； 勻 漿 機： motor cordless749540-0000；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 覆盆子提取物的制備：取干燥的中藥覆盆子500 g磨成細粉，于乙醇中回流提取，過濾，減壓蒸發(fā)，凍干。提取物根據(jù)凍干粉的干重估計，產(chǎn)率為10.6%。

1.4.2 建立尼古丁成癮模型劑量設計：選取健康SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（220～250）g，隨機分為空白對照組（生理鹽水），模型對照組（0.4 mg/kg尼古?。?，藥物對照組（0.4 mg/kg尼古丁 +地西泮），覆盆子高劑量組（0.4 mg/kg尼古丁+覆盆子提取物200 mg/kg），覆盆子低劑量組（0.4mg/kg尼古丁+覆盆子提取物100 mg/kg）。除空白組外，其余4組每天皮下注射尼古丁0.4 mg/kg/d，共7 d，制備尼古丁成癮模型。最后一次注射尼古丁后24 h，藥物對照組給予地西泮（根據(jù)臨床劑量0.1 mg/kg體質(zhì)量），覆盆子高、低劑量組分別灌胃覆盆子提取物200 mg/kg、100 mg/kg，連續(xù) 5 d，最后一次給藥 1 h后，用高架十字迷宮測其焦慮行為。

1.4.3 行為學指標測試：高空十字架是由2個開放臂和2個閉合臂以及1個中心部分（10 cm×10 cm）組成。若大鼠在開放臂的時間探索增加，那么其焦慮程度較低，若大鼠在開放臂的探索時間減少，那么其焦慮程度較高。實驗室內(nèi)光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，并保持安靜。將每只大鼠置于高空十字架（EPM）的正中央（頭面向開放臂）釋放，大鼠在迷宮中的行為被視頻跟蹤系統(tǒng)自動記錄，每只大鼠測試時間為5 m in，實驗人員在距離測試箱2 m處觀察并記錄下大鼠的活動狀況。每一只動物完成測試后，清理糞便，并對裝置用酒精進行徹底清潔消毒。

測試指標：進入到開放臂次數(shù)（OE open arm entry）：即進入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠 4個爪均進入到臂內(nèi)開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，那么該次進入活動完成；進入到開放臂的時間（OT open arm time）：進入到開放臂停留的時間，單位：秒（s）；進入到閉合臂次數(shù)（CE close arm entry）：即進入到任一閉合臂的次數(shù)，以大鼠4個爪均進人到臂內(nèi)開始；進入到閉合臂時間（CT close arm time），進入到閉合臂停留的時間，單位：秒（s）。 由以上指標分別計算出：①進入到開放臂和閉合臂的總次數(shù)（OE+CE）：表示大鼠的自發(fā)活動（locomotor activity）；② 進開放臂次數(shù)比例（OE%）=OE/（OE+CE）×100%；③開放臂停留時間比例（OT%）=OT/（OT+CT） ×100%

1.4.4 海馬中去甲腎上腺素（NE）的含量測定：所有大鼠都完成高架十字迷宮（EPM）測試后，立即將每只大鼠斷頭處死，將大腦放在冰盤上，剪開顱蓋和腦膜，剝離組織后，迅速取出左右兩側(cè)海馬，稱其質(zhì)量后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱里存放。

繪制線性回歸方程：取去甲腎上腺素（NE）標準品約2.5 mg，精密稱定，用0.1 mol/L HClO4溶解并定容到50 m L作為對照品貯備液。精密吸取貯備液10、20、40、80、160 μL，分別稀釋成 1.25、2.5、5、10、20ng/μL，以濃度（c）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，并進行線性回歸，得出回歸方程。

海馬中去甲腎上腺素（NE）的含量測定：在海馬樣品中加入-4℃保存的0.1 mol/L高氯酸處理液0.1 g/m L，置于冰水混合物中用勻漿機勻漿1 min。將上述物質(zhì)放入離心機中，以15 000 r/m in離心20 min，吸取上清液。將上清液再次以15 000 r/min離心20 m in，上清液以0.22μm的微孔濾膜過濾。以50μL微型注射器吸取20μL進樣，高效液相色譜系統(tǒng)檢測。

色譜條件色譜柱為4.6×250 mm，Kromasi 100-5Cl8，流動相為甲醇∶磷酸二氫鉀（0.15 mol/L pH=5.5） =1∶9等度洗脫，流速為 l m L/min，室溫，波長280 nm，樣品中各主要組分用外標法進行定量。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 覆盆子提取物對大鼠OE%和OT%的影響

結果顯示（表1）：在高架十字迷宮中，與空白對照組相比，尼古丁戒斷大鼠在開放臂的逗留次數(shù)、時間明顯減少（P＜0.05）；與模型對照組相比，藥物對照組能增加其次數(shù)、時間（P＜0.05），覆盆子高劑量提取物作用效果更顯著（P＜0.01）。

表1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠進入開放臂次數(shù)比（OE%）、開放臂停留時間比（OT%）的影響（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

表1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠進入開放臂次數(shù)比（OE%）、開放臂停留時間比（OT%）的影響（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01Note： Compared with the blank control group， *P＜0.05， **P＜0.01； compared with the model control group， #P＜0.05，##P＜0.01

空白對照組8 45.97±5.55 49.69±3.19模型對照組 8 29.78±10.60* 32.85±4.69**覆盆子高劑量組 8 43.75±6.71## 45.70±9.00##覆盆子低劑量組 8 34.48±7.26 35.49±6.37藥物對照組 8 38.25±10.13# 39.69±8.99#

2.2 海馬中NE的含量

結果顯示（圖1）：與空白對照組相比，尼古丁成癮大鼠海馬中去甲腎上腺素的含量顯著升高（P＜0.01），與模型對照組相比，覆盆子高劑量組、覆盆子低劑量組可降低海馬中去甲腎上腺素含量（P＜0.05），藥物對照組效果更顯著（P＜0.01）。

3 討論

許多研究表明，在EPM測試中上癮的物質(zhì)包括尼古丁和乙醇，在戒斷期間可產(chǎn)生嚴重的焦慮樣行為。自發(fā)活動的增加就是一個重要的行為學指標，暗示嚙齒類動物的焦慮樣行為[14]。本實驗結果表明，尼古丁戒斷大鼠可表現(xiàn)出焦慮，其在開放臂停留的時間與空白組相比較短，進入開放臂次數(shù)也相對減少。目前，藥物治療是抗焦慮的最直接治療方法[15]，代表藥物地西泮臨床應用較為廣泛，本實驗也觀察到地西泮可明顯減輕焦慮行為，然而，眾所周知的苯二氮類藥物具有很大的局限，近來中草藥在治療情緒障礙如抑郁癥和焦慮變得更受歡迎了。據(jù)報道，在迷宮實驗中酸棗仁可大大改善小鼠的焦慮行為[16]。在目前的研究中，200 mg/kg的覆盆子提取物可明顯改善尼古丁戒斷期間大鼠的焦慮行為，而低劑量覆盆子提取物作用效果不太明顯，說明覆盆子提取物對焦慮樣行為的作用效果與給藥劑量存在一定關系。

圖1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠海馬NE含量的影響Fig.1 Effect of Raspberry on NE Content in H ippocam pus of Rats w ith Nicotine Withdrawal

尼古丁可增強膽堿能系統(tǒng)的活性，破壞腦細胞增殖與分化之間的協(xié)調(diào)性，使細胞由分裂增殖轉(zhuǎn)向分化。尼古丁可增強血清素類遞質(zhì)系統(tǒng)如多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5hydroxy tryptamine，5-HT）等的合成、釋放和代謝活性[17-18]，這可能與興奮性神經(jīng)精神癥狀的產(chǎn)生有關。許多中樞神經(jīng)遞質(zhì)都參與尼古丁成癮的形成過程，主要包括 DA、阿片肽（opioid peptides，OP）、谷氨酸（glutamate，Glu）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、5-HT、NE。尼古丁可直接刺激 NE能神經(jīng)末梢，還可通過誘導 γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的釋放進一步刺激NE的分泌。

本實驗條件下觀察到高、低劑量的覆盆子均有降低大鼠海馬內(nèi)NE的趨勢，提示降低海馬中NE的釋放，可能是覆盆子抗尼古丁戒斷焦慮作用的重要環(huán)節(jié)之一。本研究結果顯示：與空白對照組比較，模型組大鼠海馬中NE含量明顯升高，表明焦慮產(chǎn)生時腦內(nèi)NE釋放增加；與模型組相比較，經(jīng)治療后對照組、覆盆子組大鼠海馬中NE含量均降低，表明覆盆子對大鼠海馬組織的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有降低作用，其抗焦慮癥的作用機制可能與降低腦內(nèi)海馬組織中NE的釋放有關。

綜上所述，本實驗探究覆盆子對尼古丁戒斷期間焦慮樣行為和海馬中NE水平的作用。覆盆子治療可緩解焦慮樣行為，改善由尼古丁戒斷引起的海馬中NE含量的增加。這些結果表明，覆盆子通過海馬中的去甲腎上腺素能使神經(jīng)系統(tǒng)恢復正常來治療嚙齒類動物尼古丁戒斷期間的焦慮樣行為，進一步為覆盆子治療尼古丁戒斷提供了重要的依據(jù)。