何天鵬 王冬 王東亮 趙婧 高欣 袁媛

腦血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）又名腦卒中，是危害人類健康與生命的常見病和多發(fā)病，指由各種原因引起的腦部血液循環(huán)障礙、導致的局部或全腦神經功能受損的一種疾病。其中缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）約占CVD 的80%，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、并發(fā)癥多等特點[1]。ICVD 中以大腦中動脈梗死最為常見[2]。因此，在實驗動物身上模擬人類大腦缺血性疾病時，選擇合適的動物模型就十分重要。腦缺血模型包括全腦缺血和局灶性腦缺血：全腦缺血模型就是對頸部大動脈進行結扎，所造成的彌漫性腦缺血模型；局灶性腦缺血模型則是對腦部特定血管給予栓子干預，根據栓子來源，可分為光化學誘導、線栓、自體血栓，由于線栓法制作簡便，且可控制再灌注，故應用更為廣泛[3]。1986 年Koizumi 等[4]首先報道了利用線栓法制備短暫性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，隨后Longa 等[5]于1989 年在此方法上做了改進，現(xiàn)今已成為相對成熟的局灶性腦缺血模型。本文旨在對該模型制作過程中多個細節(jié)進行探討，希望能給廣大臨床科研工作者提供經驗借鑒。

一、模型動物選擇

1.品系：建議選擇C57BL/6 小鼠。國內外有很多專家學者選用sprague-dawley（SD）大鼠，認為大鼠易存活且術后抗感染能力強[6]。但也有研究表明，相對大鼠，小鼠有更多的優(yōu)勢，如容易控制、遺傳背景更為單一且便于飼養(yǎng)等特點。更重要的是，更多基于C57BL/6 背景的轉基因小鼠被大量使用，存在著更多的科研價值和研究方向[7-8]。因此，在技術條件允許的情況下，建議選擇C57BL/6 小鼠。

2.年齡、體質量：推薦選擇2 月齡、體質量20～25 g 的小鼠，因為其正處于青年期，身體各部與腦血管發(fā)育都相對完善，血管彈性也較好，便于手術操作。此時需注意，年齡與體質量兩個條件必須同時吻合，以排除過于肥胖或者因年老血管彈性減弱的老鼠。

3.性別：以雄性為宜，有大量研究表明，雌激素具有舒張血管、抗氧化應激，拮抗興奮性神經遞質的作用，對于腦血管疾病是一種極為重要的保護性激素[9-11]。制作MCAO 模型以及根據實驗需要所采用的給藥干預，應排除雌激素的干擾。

二、術前準備

術前1 d，實驗鼠單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，濕度60%±5%，避免互相干擾接觸。術前應禁食8 h、禁水4 h，以減少手術過程中的誤吸可能[12]。在手術開始前，腹腔注射10%葡萄糖0.5～1 mL，以保證術中老鼠的的能量供給。實驗器具應嚴格消毒，術者嚴格按照無菌操作進行。手術完成后腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 mL，以恢復術中丟失的體液。

三、麻醉藥物的選擇

麻醉藥物的選擇對于手術的成敗和術后老鼠的存活率至關重要，目前常用的有液體和氣體兩種。

（一）液體麻醉

液體麻藥主要有巴比妥類、氨基甲酸乙酯類、水合氯醛、非阿片類等。

1.巴比妥類：以戊巴比妥鈉作為代表，常用劑量為1%，以50 mg/kg 進行腹腔注射，但其鎮(zhèn)痛效果不佳，且麻醉深度不易控制，故不建議使用。

2.氨基甲酸乙酯類：氨基甲酸乙酯即烏拉坦，多作為致死性麻藥，麻醉時間過長，易造成術后缺氧和CO2潴留，不宜在顱腦手術中使用[13]。

3.水合氯醛：現(xiàn)在大多數(shù)實驗室使用的是10%的水合氯醛，其操作簡便，麻醉深度易于控制。但對于MCAO 手術，筆者不予推薦，因為前期大量的動物實驗中動物死亡率過半，原因有以下兩點：（1）MCAO 手術采用仰臥位，使用水合氯醛麻醉可以引起呼吸道腺體分泌增多，產生大量黏液，在操作過程中，筆者發(fā)現(xiàn)動物多數(shù)出現(xiàn)打嗝現(xiàn)象，故術中呼吸抑制是死亡原因之一；（2）動物術后蘇醒時間過長，且不易排便，腹部膨隆，解剖后發(fā)現(xiàn)，動物腸腔內多處脹氣，系水合氯醛過量引起的麻痹性腸梗阻，可導致死亡。

4.非阿片類：多采用鹽酸氯胺酮和鹽酸甲苯噻嗪的混合物，有條件的情況下，推薦采用此液體麻藥。該麻藥起效快，鎮(zhèn)痛效果強，蘇醒較快，不增加氣道分泌物，無明顯的呼吸抑制且不易留下麻醉后遺癥。

（二）氣體麻醉

氣體麻醉主要為氟烷類，以安氟烷和異氟烷作為代表，其操作更為簡便，可以通過調控吸入藥物的濃度靶控麻醉深度，麻醉后動物容易蘇醒，術后精神狀態(tài)好，成活率高[14]。氣體麻醉是目前性價比最高的麻藥，建議推廣應用。

四、線栓的選擇

線栓的選擇是MCAO 模型制備的重要環(huán)節(jié)。線栓過細，堵不住血管，過粗又容易撐爆血管，所以需要選擇適宜長度和直徑的線栓。目前很多實驗多采用魚線或尼龍線，自制線栓，雖然節(jié)約成本，但筆者認為其是極不科學的，因為手工制作存在個人誤差，且小動物血管變異較大，自制的線栓無論是用火燙頭的魚線，還是用硅膠嵌合的尼龍線，都會存在線栓頭脫落的現(xiàn)象，將大大降低手術的成功率并延長不必要的手術時間。因此，筆者建議購買專門廠家定制的線刷，且同一根線栓建議避免反復使用。

五、插線方式

大腦擁有豐富的環(huán)狀側枝循環(huán)血液供給，所以插線方式和深度應嚴格掌控，必須保證栓塞大腦中動脈起始部，以阻斷同側和對側雙側的血液循環(huán)，保證模型制作的梗死區(qū)域即為大腦中動脈供血區(qū)。目前常用的插線方式，有頸總動脈和頸外動脈進線兩種。

1.頸總動脈插線：頸總動脈插線常用且便于操作，對于初學者建議采用該方式，缺點是手術側頸總動脈完全被破壞，待線栓取出后，供血來自于對側基底動脈環(huán)，將破壞動物原有血管生理構型，有一定的術后死亡風險。

2.頸外動脈插線：頸外動脈插線具有一定的難度，耗時較長，分離結扎血管較多，且術中易出血，初學者不易采用。但線栓取出后，血供來自于同側頸總動脈和對側基底動脈環(huán)，即為原來的生理血供方式，術后存活率會大大提高。待操作者熟練后，筆者建議采用頸外動脈插線方式。

3.插線深度：對于20～25 g 的小鼠，插線深度應掌控為0.8～1.2 cm，或者有輕微阻力即可，有條件可以采用多普勒血流儀對術中中動脈血流進行全程監(jiān)測，切不可插入過深，以免造成蛛網膜下腔出血。

六、手術與蘇醒

由于小鼠體積較小、血管較細，所以全程必須采用顯微操作，這要求施術者有很好的解剖常識。注意事項包括：（1）操作前必須嚴格消毒備皮，清除毛發(fā)，這些都會對操作視野進行干擾；（2）切開皮膚動作要輕柔，注意不要壓迫氣管，以及損傷同側迷走神經；（3）操作時間應嚴格把控在15 min 以內，時間越長，術中死亡風險越大；（4）在操作時還應采用可控式溫度反饋系統(tǒng)，全程監(jiān)測使用探頭測老鼠肛溫，以保證老鼠體溫在37℃左右。

待線栓插入成功后，固定線栓，連續(xù)縫合皮膚切口。這時同樣需要注意兩個問題。第一，在確定的缺血時間內，應嚴格保證老鼠處于深度麻醉狀態(tài)，需注重前期麻醉藥的選擇和計量，若缺血期間老鼠蘇醒，因為疼痛而造成的頭部擺動，可能影響線拴在體內的位置；第二，保證體溫在37℃，這個時間的溫度會影響梗死體積的生成，溫度過低，會由于低溫保護作用，造成梗死灶體積過小或每只模型體積不一致；而溫度過高，動物容易死亡。

七、術后護理

1.術后抗感染：手術后大多數(shù)動物死亡會源于術后感染，所以抗感染是重要的護理環(huán)節(jié)。首先切口周圍應嚴格用碘伏消毒，消毒范圍不應低于1.5 cm；同時，從術后當天開始，每天腹腔注射4 萬單位青霉素，連續(xù)注射7 d；術后生活的籠具墊料也應進行嚴格的消毒滅菌，墊料需每天更換一次。

2.術后鎮(zhèn)痛：術后切口強烈的疼痛，也是實驗動物死亡因素之一。在縫合傷口后，可以選擇性的以2.5 mg/kg 標準于小鼠尾靜脈注射曲馬多，以達到鎮(zhèn)痛目的[15]。

3.術后飲食：MCAO 術后1 周內，為死亡高發(fā)期，其中一個重要的原因就是術后自主進食不佳[16]。術后應采用流食，可以喂養(yǎng)奶粉，或用10%蔗糖代替。如若1 d 內小鼠仍沒有進食行為，可以采用灌胃處理。

4.環(huán)境溫度：術后飼養(yǎng)的環(huán)境溫度應在27℃±0.5℃，不宜過高，過高會出現(xiàn)灌注流速太大引起的腦出血，濕度為70%±5%，通風良好，避免噪聲及動物間的相互干擾。

八、模型評價

手術動物蘇醒后，根據Longa 法進行行為學評分，其是模型成功與否且保證一致性的客觀指標[5]。具體評分標準：（1）沒有神經功能損傷的癥狀，小鼠能夠正?；顒?、進食，評0分；（2）將小鼠尾巴提起后，右前肢屈曲，評1 分；（3）將小鼠放置于平板上，向右轉圈，評2 分；（4）將小鼠放置平板上，用手推向右傾倒，評3 分；（5）小鼠右側肢體偏癱，不能自發(fā)行走意識朦朧或喪失，評4 分。評分在1～3 分的小鼠認為MCAO 模型成功；評分為0 分、4 分的小鼠建議予以剔除。

綜上所述，MCAO 模型是研究缺血性腦損傷的經典老鼠造模模型，但在MCAO 制作過程中，并沒有統(tǒng)一的評價標準。筆者經過反復實驗并從失敗中積累經驗總結作一綜述，希望能為從事相關研究的科研工作者提供借鑒。本課題組MCAO模型制備中還有很多不完善的地方，在今后的實踐中也會不斷努力完善，為探索缺血性腦損傷疾病的機制和改進治療干預的方法起到推動作用。

志 謝

感謝甘肅省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學一科、甘肅省人民醫(yī)院麻醉手術科、甘肅省人民醫(yī)院臨床研究與轉化醫(yī)學研究所、蘭州大學生命科學學院、甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心的各位老師以及同事對本次實驗的合力資助與技術支持！