宋國婧 王永福

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解過程中沉默致病基因或蛋白片段表達的技術(shù)。運用RNAi干擾技術(shù)，可在細胞基因轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達，來達到沉默基因的效果[1]，在遺傳性疾病、腫瘤和自身免疫性等疾病的治療中已廣泛應(yīng)用該項技術(shù)[2-3]。自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指人體對自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答致使自身組織器官受損而引起的疾病，主要包括類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥綜合征(Sjogren's syndrome，SS)、系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)等，臨床上表現(xiàn)為產(chǎn)生自身抗體和免疫調(diào)節(jié)異常[4]。小干擾RNA(small interfering，RNA，siRNA)具有帶負電荷、相對分子質(zhì)量大和不穩(wěn)定的理化特性，在體內(nèi)易被降解且不易穿過細胞膜，需要與合適的載體相結(jié)合才能被運送至靶細胞。目前，常采用的載體遞送方式分為病毒載體遞送和非病毒載體遞送兩大類[5]。

1 siRNA在自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)研究中的應(yīng)用

AID的發(fā)病機制為過度免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大量免疫細胞和免疫球蛋白堆積于正常組織，并損傷正常組織，使之發(fā)生病變和功能障礙。RNAi技術(shù)應(yīng)用于AID，可以使相關(guān)疾病的致病基因或蛋白沉默，從而達到緩解或治療AID的目的，并深入了解其發(fā)病機制，提出新的治療靶點[6]。

1.1 siRNA在RA治療中的應(yīng)用 RA是一種病因未明的、慢性、以炎性滑膜炎為特征的全身性AID，臨床表現(xiàn)多為慢性、對稱性、以手足小關(guān)節(jié)為主的多關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)外病變，其確切病因還未完全闡明。Liu S等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者的外周T淋巴細胞中可觀察到鈣存儲異常，細胞內(nèi)鈣信號傳導通路參與多種免疫反應(yīng)。因此，假設(shè)鈣通過釋放激活鈣(CRAC)通道孔而形成的亞單位(CRACM1)進入細胞內(nèi)，進而參與RA的發(fā)生過程。因此利用慢病毒載體將小鼠CRACM1 siRNA遞送至患有膠原蛋白誘導關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠的局部關(guān)節(jié)和引流淋巴結(jié)(DLN)，從而沉默CRACM1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滑膜細胞中的鈣流入下降、CIA組織病理學改變減輕，以及關(guān)節(jié)中炎性細胞因子，如IL-6、IL-17A 和IFN-γ的水平降低。另外，CRACM1-shRNA在體外以及CIA關(guān)節(jié)中可減少骨髓來源的破骨細胞數(shù)量，這與血清和關(guān)節(jié)中的RANKL水平降低有關(guān)?？傊?，通過沉默CRACM1的表達，可以抑制鈣流入，減緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進程，并且有可能成為治療RA的新方法。Lee SJ等[8]研究發(fā)現(xiàn)RA發(fā)病機制中涉及到的各種促炎性細胞因子中，腫瘤壞死因子(TNF)-α在其他細胞因子的釋放和慢性炎癥的誘導過程中均起到關(guān)鍵作用。siRNA在體內(nèi)生理環(huán)境中的穩(wěn)定性較差，很難被遞送至靶細胞。因此采用了一種聚合靶向TNF-α siRNA的納米復合物(poly-siRNA)來治療RA。5周后，與甲氨蝶呤(5 mg/kg)治療組相比，靜脈內(nèi)注射psi-tGC-NP能夠顯著抑制CIA小鼠的炎癥，并減少骨侵蝕，降低血清TNF-α含量。Sun Z等[9]發(fā)現(xiàn)siRNA1和siRNAc分別是IL-1β和TNF-α最有效的干擾序列，siRNA1 和siRNAc共轉(zhuǎn)染后，IL-1β和TNF-α的表達在mRNA和蛋白水平上均受到抑制，同時細胞增生、集落形成和遷移能力降低，炎性因子減少。Song J等[10]運用PDAPEI/pDNA遞送siRNA，從而降低膝關(guān)節(jié)滑液TNF-α的表達，減輕臨床癥狀。有學者研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，沉默Sp1會導致成纖維細胞樣滑膜細胞中TNF-α生成明顯減少，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥狀[11]。Wang H等[12]研究表明，與對照組小鼠相比，CARD11siRNA沉默組中CIA小鼠T輔助細胞17型(Th17)應(yīng)答和促炎細胞因子的水平均有降低，炎癥反應(yīng)減弱。Zhang T等[13]發(fā)現(xiàn)靜脈注射IL-15R siRNA能夠減緩關(guān)節(jié)炎大鼠疾病的發(fā)展進程，緩解臨床和影像學的癥狀表現(xiàn)。Lin HC等[14]研究證實，用siRNA沉默5-LOX可以降低TNF-α誘導的血清MCP-1水平，并減輕小鼠足跖腫脹現(xiàn)象，表明5-LOX抑制劑可以用于治療炎癥性關(guān)節(jié)炎。馬莎等[15]研究證明沉默survivin基因的表達，可使RA患者滑膜成纖維細胞survivin的mRNA及蛋白表達水平顯著降低，滑膜成纖維細胞增生能力顯著下降，說明靶向siRNA通過下調(diào)survivin的表達水平，可以減輕RA患者的癥狀，并改善其生活質(zhì)量。丁爽等[16]研究發(fā)現(xiàn)使用RNAi技術(shù)沉默結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達，觀察其對RA患者成纖維樣滑膜細胞(FLS)凋亡的影響，證實成纖維樣滑膜細胞的增生凋亡失衡在RA患者滑膜病變中發(fā)揮主要作用。沉默F(xiàn)LS中CTGF基因的表達后，F(xiàn)LS凋亡顯著增加，而survivin基因表達明顯下降。因此推斷出，CTGF減少RA患者成纖維樣滑膜細胞凋亡的作用很可能是通過維持survivin基因表達實現(xiàn)的，可以通過抑制survivin基因的表達來延緩RA疾病的進展。靶向特異性細胞因子的療法預示著RA治療新時代的到來。

1.2 siRNA在SLE治療中的應(yīng)用 SLE是一種累及多系統(tǒng)、多器官并能夠產(chǎn)生多種自身抗體和免疫復合物的AID。SLE患者臨床上常表現(xiàn)為皮膚、關(guān)節(jié)、漿膜、心臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)的損傷，而免疫系統(tǒng)功能的紊亂主要由T淋巴細胞減少、T細胞抑制功能降低和B細胞過度增生引起。但到目前為止，確切的病因尚不十分清楚[17]。Wang ZH等[18]研究發(fā)現(xiàn)CD40-siRNA可以降低血清中IL-17、IFN-γ和抗dsDNA抗體的濃度，同時可以提高IL-4的濃度。而當抑制CD40 mRNA和蛋白的表達后，可降低小鼠的炎癥反應(yīng)和疾病活動性，由此可見CD40-siRNA對SLE具有治療作用。Li M等[19]通過全基因組分析表明，白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)與SLE在人類中的易感性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IRAK1在B6.MRL-Faslpr/Nju(B6.lpr)小鼠和SLE患者的外周血單核細胞(PBMC)和脾細胞中過表達。用IRAK1小分子抑制劑(IRAK1/4抑制劑或IRAK-Inh)于腹膜內(nèi)治療后，可以明顯減輕B6.lpr小鼠的炎癥反應(yīng)和腎損傷。IRAK-Inh siRNA可降低SLE 患者PBMC中NF-κBp65 的磷酸化水平，從而降低炎癥反應(yīng)程度。因此推測，IRAK1可以成為SLE和TLR-7誘導的SLE患者免疫細胞中IRAK-1和IRF-7的活化，可延長MRL/lpr其他炎性疾病抗炎治療的潛在靶點。Wei S等[20]發(fā)現(xiàn)SLE患者Pin1及其下游靶點IRAK-1和IRF-7異常激活。此外，使用Pin1 shRNA抑制Pin1的表達，并阻斷和B6.lpr小鼠的總體生存期。Pin1靶向治療為SLE提供了一個新的治療方向。Lennard Richard ML等[21]研究證明，F(xiàn)li-1是Ets的家族成員，在SLE的發(fā)病機制中起到一定作用。CCL5是一種炎性細胞因子，可募集白細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞等免疫細胞到達炎癥部位，并參與介導多種免疫性疾病，包括哮喘、RA和SLE。用FLi-1特異性siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，可使腎臟中炎癥趨化因子CCL-5 mRNA的表達降低，并抑制內(nèi)皮細胞中CCL5蛋白的表達。Ets1是Fli-1的啟動子，可激活CCL5的負性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，減少腎臟中炎癥細胞的浸潤，并延長患者生存期。Ripoll E等[22]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射Chol-siRNA后，小鼠腎組織中CD40 mRNA表達受到抑制，顯著降低了初始CD3+T細胞和漿細胞的浸潤，以及IgG和C3在腎小球的沉積，從而減輕腎臟的炎癥反應(yīng)。Nagpal K等[23]研究發(fā)現(xiàn)PP2A是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在SLE的病理學中起重要作用。Ikaros與PP2A的內(nèi)含子位點結(jié)合，通過募集組蛋白脫乙酰酶HDAC1，來抑制PP2A的表達。用Ikaros siRNA沉默PP2A的表達，為治療SLE提供了新思路。

1.3 siRNA在SS治療中的應(yīng)用 SS是一種以淋巴細胞浸潤和特異性自身抗體產(chǎn)生(抗SSA/SSB)為特征，累及淚腺、唾液腺等外分泌腺體，進而出現(xiàn)多系統(tǒng)損害的慢性AID，臨床上多表現(xiàn)為口干和眼干。Li Q等[24]構(gòu)建鞘氨醇1- 磷酸受體-1(S1P1)siRNA慢病毒載體并感染人唾液腺細胞(HSG)，觀察其對SS的可能療法。結(jié)果顯示，S1P1 siRNA可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSG細胞，并有效的特異性抑制S1P1基因的表達，同時降低炎癥細胞因子的表達水平，發(fā)揮治療作用。Pauley KM等[25]利用靶向半胱天冬酶-3(caspase-3)的siRNA沉默caspase-3的表達，研究其是否可以阻止細胞因子誘導的HSG細胞凋亡。該項研究使用碳酰膽堿(一種毒蕈堿受體特異性配體)作為促分泌素，與靶向半胱天蛋白酶3的siRNA結(jié)合，并將其遞送至細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種促分泌siRNA可以降低HSG細胞中的caspase-3 mRNA和蛋白的表達，并抑制唾液腺上皮細胞中細胞因子誘導的細胞凋亡，這對于改善SS的臨床癥狀至關(guān)重要。Ectodysplasin-A2(EDA-A2)是與外胚層發(fā)育不良受體(XEDAR)結(jié)合的腫瘤壞死因子的超家族成員之一，Sisto M等[26]在原發(fā)性干燥綜合征(pSS)患者的唾液腺上皮細胞(SGEC)中EDA-A2的表達和生物學活性的研究中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，EDA-A2及其受體、XEDAR mRNA 和蛋白質(zhì)在pSS SGEC中過表達，EDA- A2/XEDAR通過胱天蛋白酶-3的介導參與細胞凋亡，表明EDA-A2/XEDAR 系統(tǒng)可能成為pSS基因治療的新靶點。龐春艷等[27]研究α-胞襯蛋白(α-Fodrin)特異性siRNA對SS動物模型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠細胞因子IFN-γ和IL-4表達水平的影響，探討α-Fodrin siRNA治療NOD的可能性。將成功構(gòu)建的α-Fodrin siRNA經(jīng)尾靜脈注射NOD小鼠，其中對照組和空載體組小鼠分別注射同等劑量的PBS和空載體。注射1、3、5、7 d后，分別對各組小鼠進行尾靜脈采血，檢測4組小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-4的表達水平，以及肺臟組織中α-Fodrin mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，在NOD小鼠中注射α-Fodrin siRNA后，血清中IL-4的水平升高、IFN-γ/IL-4的比值降低，同時α-Fodrin mRNA表達水平和α-Fodrin表達水平下降，提示α-Fodrin siRNA可以通過減輕NOD小鼠炎癥反應(yīng)，并延緩SS病情。

1.4 siRNA在SSc 治療中的應(yīng)用 SSc 也稱硬皮病，是一種以局限或彌漫性皮膚增厚和纖維化為主要特征的AID，病變可表現(xiàn)為皮膚纖維組織增生和血管洋蔥皮樣變化，但至今病因不明。Evans IC等[28]利用c8orf4 siRNA下調(diào)特發(fā)性肺纖維化(IPF)和SSc患者成纖維細胞中COX-2的表達水平，并減少COX-2派生的PGE2合成，從而減輕肺纖維化的癥狀。Morry J等[29]表明NADPH氧化酶4(NOX4)和熱休克蛋白47(HSP47)可以誘導膠原過度合成，進而導致纖維化。因此，將有效的靶向HSP47 siRNA遞送至細胞后，可使HSP47蛋白在皮膚中的表達降低至正常水平。在SSc患者真皮組織纖維化的病變中，可以觀察到TGF-β的含量升高，而siHSP47可以降低TGF-β的表達，同時可以使皮膚真皮層較之前變薄，并緩解皮膚纖維化癥狀，減少小鼠的皮膚厚度。Liu T等[30]研究發(fā)現(xiàn)PDGFR-α 在SSc成纖維細胞中過度表達并結(jié)合PDGF-AA，可以促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化。PDGFR-αsiRNA可以特異性下調(diào)PDGFR-α的表達，而阻斷其與PDGF-AA的結(jié)合后，可以抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。

2 RNAi的治療前景

將靶向siRNA遞送至細胞內(nèi)，使其沉默基因和蛋白的表達，可以緩解疾病癥狀并改善預后。因此，應(yīng)用該項技術(shù)治療AID成為目前最有前景的治療方向之一。雖然近些年來，人們對于RNAi的研究有很大進步，但是仍然存在很多不足。同時，越來越多的疾病利用生物藥物進行臨床治療，并且這類藥物可以應(yīng)用于常規(guī)治療無效的疾病。siRNA屬于生物藥物的一種，雖然臨床上已經(jīng)接受了siRNA藥物，但是它在傳遞、純化、修飾、穩(wěn)定性和免疫激活等方面仍存在很多不足。例如，裸siRNA是帶有較強負電性的高度親水性大分子物質(zhì)，若直接導入機體，則很難穿透細胞膜并作用于靶細胞，而且siRNA在體內(nèi)具有不穩(wěn)定、半衰期短、細胞靶向性差和生物利用度低等特點[31]。另外，由于血清和細胞中存在核糖核酸酶，因此siRNA在血液、組織和細胞質(zhì)中容易被酶類降解。并且在此種環(huán)境中，siRNA容易被化學修飾，而這些修飾作用可以改變其分子性質(zhì)。盡管許多反義寡核苷酸藥物可以被注射至血液，并被傳遞至某些組織中，但是它們不會通過血腦屏障，也不能進入心臟和肌肉組織。因此，目前RNAi技術(shù)的應(yīng)用僅局限于真核細胞[32]，而這些亟待解決的問題則成為當前研究的熱點，并且仍需要大量的研究來完善siRNA在AID中的應(yīng)用。