李春欣，朱光澤

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130021)

氧化三甲胺(trimetlylamine oxide,TMAO)是一種易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑的小分子胺。人體內(nèi)TMAO主要是以卵磷脂、膽堿、肉堿等為原料，在腸道微生物菌群的作用下生成三甲胺(trimethylamine,TMA)，TMA經(jīng)過門靜脈流入肝臟，在肝臟中黃素單加氧酶的作用下活化成TMAO[1]。人體內(nèi)TMAO含量較少，其血漿濃度主要與人們的飲食習(xí)慣、腸道菌群活性及關(guān)鍵性酶的活性有關(guān)。本文主要針對(duì)TMAO與幾種常見慢性病的關(guān)系及檢測(cè)TMAO的主要方法進(jìn)行綜述，以期為臨床研究提供理論參考。

1 TMAO與慢性病的關(guān)系

1.1 TMAO與心腦血管疾病

2011年，Wang等[2]研究表明，TMAO在血漿中的濃度與人體動(dòng)脈粥樣硬化的形成及面積大小有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，喂食TMAO 20周后的小鼠主動(dòng)脈根部出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，繼續(xù)喂食TMAO以提高TMAO血漿濃度后，小鼠粥樣硬化斑塊面積也隨之增加。Tang等[3]歷時(shí)3年的隊(duì)列研究檢測(cè)了4 007名受試者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMAO血漿濃度高的研究對(duì)象比TMAO血漿濃度低的研究

對(duì)象動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)病率明顯提高；冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果顯示，血漿TMAO濃度的升高與主要不良心血管事件(腦卒中和心肌梗死)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，心力衰竭的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)是心腦血管疾病的主要死因。心力衰竭是由慢性炎癥及其代謝產(chǎn)物、胃腸道功能障礙、細(xì)菌失調(diào)等多種因素通過多種渠道共同引起的。一項(xiàng)研究把104例臨床心力衰竭患者分成TMAO<5 μmol/L和TMAO≥5 μmol/L組，結(jié)果證實(shí)TMAO血漿濃度與N末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)呈正相關(guān)，與左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈負(fù)相關(guān)[4]。另一項(xiàng)通過對(duì)720例穩(wěn)定性心絞痛患者測(cè)定血漿TMAO濃度的研究發(fā)現(xiàn)，患者空腹TMAO濃度均在5 μmol/L上下波動(dòng)，且較高的血漿TMAO濃度預(yù)示患者長(zhǎng)期死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[5]?？紤]原因可能是血漿TMAO濃度增加改變了血管壁原有結(jié)構(gòu)和功能，增加了血管壁的通透性，促進(jìn)了血管的炎癥發(fā)生，減弱了對(duì)擴(kuò)血管物質(zhì)(一氧化氮等)的敏感性，進(jìn)而加快患者的心力衰竭發(fā)展進(jìn)程。Ufnal等[6]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，血漿TMAO濃度增加還可以提高體內(nèi)血管緊張素Ⅱ的縮血管效應(yīng)，促進(jìn)縮血管蛋白質(zhì)的合成，延長(zhǎng)血管緊張素Ⅱ的升壓效應(yīng)。這說明高水平TMAO可能與高血壓病存在一定關(guān)系，而高血壓病又是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。除此之外，有研究通過對(duì)200例冠心病患者研究證實(shí)，TMAO與慢性心房顫動(dòng)(房顫)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也有關(guān)，其主要機(jī)制可能是TMAO通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子，或通過心房重構(gòu)和心肌細(xì)胞凋亡等來誘導(dǎo)心房電不穩(wěn)定，造成人體自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而誘發(fā)房顫[7]。不僅如此，TMAO還與腦卒中等疾病有著密切關(guān)系。徐燕飛[8]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病患者(60例)及健康對(duì)照人群(30名)測(cè)定TMAO血漿濃度發(fā)現(xiàn)，后者TMAO血漿濃度顯著低于前者，表明高TMAO血漿濃度可能是腦卒中的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。Zhu等[9]通過對(duì)血小板功能的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度TMAO可促進(jìn)血小板的反應(yīng)性增加，誘導(dǎo)血栓形成，考慮可能與TMAO通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放來激活多種激動(dòng)劑有關(guān)。結(jié)合眾多研究文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為TMAO導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制可能有以下幾方面。(1)TMAO改變了血管壁、腸道、肝臟、腎臟等重要器官的膽固醇代謝通路；(2)TMAO降低了膽汁酸Cyp7a1和Cyp27a1等轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，改變了膽汁酸池的大小與構(gòu)成；(3)TMAO升高干擾了膽固醇及脂蛋白的代謝，阻礙膽固醇從肝外組織逆向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)肝臟；(4)TMAO升高使巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體數(shù)量上調(diào)，并參與泡沫細(xì)胞的形成[10]；(5)TMAO損傷了血管壁的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)了血小板內(nèi)Ca2+的釋放，進(jìn)而活化血小板，加速血栓形成；(6)TMAO促進(jìn)環(huán)氧合酶-2、白細(xì)胞介素-6、細(xì)胞間黏附分子-1等炎癥因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

1.2 TMAO與糖尿病

Tang等[11]通過對(duì)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2MD)患者及健康人群檢測(cè)血漿TMAO濃度及TMAO前體物質(zhì)(膽堿、甜菜堿)濃度發(fā)現(xiàn)，T2MD患者血漿TMAO濃度及膽堿等前體物質(zhì)濃度比健康人群測(cè)定值要高。其中前者TMAO血漿濃度為4.4(2.8，7.7)μmol/L，后者為3.6(2.3，5.7) μmol/L，這表明TMAO與T2MD的發(fā)生可能有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與患者體內(nèi)血糖水平的相關(guān)性。Shan等[12]通過對(duì)2 694名參與者評(píng)估TMAO與T2MD的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TMAO通過阻斷胰島素在細(xì)胞中的傳導(dǎo)通路降低了患者的葡萄糖耐量和引起高血糖癥的發(fā)生。另外，Gao等[13]研究了TMAO對(duì)高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠的葡萄糖耐量的影響。結(jié)果顯示，模型小鼠空腹胰島素水平升高和胰島素抵抗增強(qiáng)，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因如磷脂酰肌醇3激酶r1(phosphatidylinositol 3-kinase r1,PI3Kr1)、胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2,IRS2)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)等及抗炎因子IL-10的mRNA水平均降低，但促炎細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1的mRNA表達(dá)增加，小鼠的葡萄糖耐量受損加劇。分析認(rèn)為TMAO使肝臟中胰島素信號(hào)通路、糖原合成、糖異生和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)增加，但降低了抑炎因子的表達(dá)。故飲食中的TMAO會(huì)加劇葡萄糖耐量受損，阻礙肝臟胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并導(dǎo)致喂食高脂肪飲食的小鼠發(fā)生脂肪組織炎癥。筆者認(rèn)為在T2MD患者中，TMAO可通過阻斷胰島素信號(hào)通路、降低細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性、增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)等方式參與T2MD的發(fā)生和發(fā)展過程。

1.3 TMAO與慢性腎臟病

TMAO相對(duì)分子質(zhì)量為75 ku，分子量較小，容易通過腎小球基底膜隨尿排出。慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者腸蠕動(dòng)減慢、有毒物質(zhì)在腸道堆積、腸黏膜充血水腫、發(fā)生炎癥反應(yīng)等都會(huì)引起腸道損傷和菌群失調(diào)[14]。而腸道損傷和菌群失調(diào)又會(huì)造成體內(nèi)TMAO增多。Vaziri等[15]通過對(duì)正常人群和CKD患者的糞便樣品進(jìn)行微生物DNA的提取和測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在CKD患者腸道中有190種微生物水平與正常人群明顯不同，提示CKD患者腸道菌群失衡嚴(yán)重。有研究采用CKD大鼠模型進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，也得到類似的結(jié)果。另外，Ramezani等[16]在尿毒癥患者的十二指腸和空腸中發(fā)現(xiàn)大量好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌，但在正常人群中沒有。腸道菌群失調(diào)會(huì)引起一系列代謝異常，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等。我們認(rèn)為CKD腸道菌群的改變必定會(huì)影響血漿TMAO濃度，而血漿TMAO增高，又會(huì)損傷腎臟血管，促進(jìn)CKD的發(fā)展。Tang等[17]通過對(duì)521例CKD患者測(cè)定空腹TMAO血漿濃度發(fā)現(xiàn)，CKD患者血漿TMAO濃度明顯高于正常人群，且較高水平的TMAO會(huì)引發(fā)腎動(dòng)脈血管粥樣硬化、膠原沉積、腎組織逐漸纖維化及腎臟濾過功能受損等。當(dāng)腎臟功能受損嚴(yán)重時(shí)又會(huì)進(jìn)一步加重體內(nèi)TMAO濃度，形成惡性循環(huán)。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖且腎損傷動(dòng)物體內(nèi)，腎損傷分子-1水平與血液中TMAO含量成正比，提示高水平TMAO可能是促進(jìn)腎臟纖維化的重要危險(xiǎn)因素。總之，TMAO升高可促進(jìn)CKD患者發(fā)生血管炎癥反應(yīng)，促進(jìn)環(huán)氧合酶-2、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子表達(dá)、提高血小板反應(yīng)性、加速血栓形成等，參與CKD的發(fā)生和發(fā)展。

2 TMAO的測(cè)定方法

現(xiàn)階段測(cè)定TMAO的方法主要有比色法、離子色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)等方法。但這些方法均存在一定缺陷，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大規(guī)模篩查，詳述如下。

2.1 比色法

(1)苦味酸比色法。用三氯化鈦(TiCl3)把TMAO還原成TMA，測(cè)定TMA的含量，進(jìn)而換算成TMAO的含量。(2)雷氏鹽比色法。取血清樣品，用濃鹽酸下調(diào)pH，在恒溫箱中冷卻，打開蠕動(dòng)泵加入雷氏鹽飽和溶液，并不斷地?cái)嚢?。然后加入含水乙醚?0%的丙酮進(jìn)行溶解洗滌，在分離柱中進(jìn)行分離，525 nm處測(cè)定吸光度值?；蚣尤媵斆字Z，在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行檢測(cè)[19]。比色法雖然操作簡(jiǎn)單，但容易與人體內(nèi)其他胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，靈敏度較差，測(cè)定結(jié)果常偏高，并不適合人體內(nèi)TMAO的測(cè)定[20]。

2.2 離子色譜法

離子色譜法是指用低交換容量的離子交換樹脂為固定相對(duì)TMAO進(jìn)行分離，用流動(dòng)相攜帶TMAO通過電導(dǎo)檢測(cè)器，連續(xù)監(jiān)測(cè)攜帶TMAO的流動(dòng)相引起的點(diǎn)的變化，再按照色譜定量方法進(jìn)行比對(duì)分析。孫永等[21]用4 mmo1/L硝酸 + 3%乙腈作為淋洗液測(cè)定水產(chǎn)品中TMAO含量以檢測(cè)該方法的實(shí)用性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)在10 min內(nèi)即完成，且分離度良好、檢出限低。但由于生物樣品中常包含一些其他陽離子，如K+、Ca2+、Mg2+等，可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，所以用離子交換色譜法測(cè)定生物樣品中的TMAO并非最佳方法。

2.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)靈敏度高，適用于小分子低脂肪胺類測(cè)定?，F(xiàn)階段主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)兩種方法。一般用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)測(cè)定生物樣品中TMAO時(shí)，需要用TiCl3作為還原劑，使TMAO轉(zhuǎn)變?yōu)門MA，再使TMA衍生化，加上生色基團(tuán)等可被檢測(cè)的物質(zhì)，再進(jìn)行測(cè)定。Sacher等[22]用苯磺酰胺作為生色基團(tuán)測(cè)定TMA、二甲胺(dimethylamine，DMA)等化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法重復(fù)性好，靈敏度高等。Chan等[23]利用TiCl3把TMAO還原成TMA，用丙胺作為內(nèi)標(biāo)物，在堿性環(huán)境中用二乙烯基苯-羧基聚二甲硅氧烷為固定相萃取劑，吸附萃取TMA，然后用色譜儀進(jìn)行比對(duì)分析，最終使用內(nèi)標(biāo)法算出確切含量。由此看出，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)雖靈敏度高，但步驟繁瑣，成本較高，樣品衍生過程可能使TMAO發(fā)生降解，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此不適合臨床大規(guī)模篩查。

3 小結(jié)與展望

進(jìn)入21世紀(jì)以來，隨著人們生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變，慢性疾病的發(fā)病率逐年上升，對(duì)人類的威脅日益增加，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了社會(huì)的進(jìn)步和人類的健康。TMAO作為近些年較為關(guān)注的缺血損傷標(biāo)志物，對(duì)慢性疾病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)有重要的臨床意義。現(xiàn)階段測(cè)定TMAO的方法仍存在誤差較大或步驟繁瑣或成本較高等局限，因此不適合臨床實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模篩查。我們迫切需要一種快速、準(zhǔn)確并適合臨床實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模篩查TMAO的方法。隨著對(duì)TMAO測(cè)定方法的逐步試驗(yàn)和探索，我們希望通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制TMAO的產(chǎn)生。而TMAO作為慢性疾病標(biāo)志物的新希望，也會(huì)為臨床提供更科學(xué)的預(yù)防手段和治療方法。