馬濤 呂毅

西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科 精準外科與再生醫(yī)學國家地方聯(lián)合工程研究中心，西安 710061

【提要】 胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，具有高度侵襲性，患者預后極差，而早期診斷、術中精準識別腫瘤原發(fā)灶及轉移灶對改善患者預后極為重要。近年來熒光成像技術已應用于乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種實體腫瘤的早期檢測和術中定位以及病灶周圍淋巴結、組織灌注檢測等方面。本文就熒光成像技術應用于胰腺癌術中診斷及輔助治療的相關研究進展進行探討。

胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，早期癥狀不典型，具有高度侵襲性，患者預后極差，5年生存率不足5%，中位生存期僅6～10個月[1-3]。早期診斷、術中精準識別腫瘤原發(fā)灶及轉移灶對改善患者預后、提升生存質量及延長生存時間非常重要，這也是目前胰腺癌治療的主要目的[4-5]。分子影像學是應用影像學的方法對活體狀態(tài)下的生物過程進行細胞和分子水平的定性及定量研究[6]。熒光成像技術是基于分子影像學發(fā)展起來的較為成熟、應用廣泛，在腫瘤早期診斷中發(fā)揮實時、非侵入式、特異性跟蹤與探測功能的診療手段[7]。近些年熒光成像技術已獲得臨床上的認可，應用于乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結直腸癌等實體腫瘤的早期檢測及術中定位，同時根據熒光探針的理化特性也應用于病灶周圍淋巴結、組織器官灌注檢測等方面。本文介紹熒光成像技術及其在胰腺癌中的應用。

一、熒光成像技術原理

1．熒光成像基本原理：熒光成像包含靶點(靶器官)、探針及成像系統(tǒng)3個要素。術前通過靜脈或者局部注射熒光探針，經過一段時間的生物代謝，熒光探針到達靶器官，或可與其相應的靶點結合。術中使用具有特定波長的激發(fā)光照射目標部位，產生另一波段的熒光信號，被成像系統(tǒng)捕獲，即可實現(xiàn)腫瘤病灶的精準定位。每種熒光探針根據理化性質不同，其激發(fā)波長與發(fā)射波長均不相同，也就需要針對探針的成像系統(tǒng)進行熒光信號的激發(fā)與采集[8]。由于熒光信號都非常微弱，所以一般的成像系統(tǒng)還包含信號增強模塊[9]。

2．臨床常用熒光探針：熒光成像的核心在于熒光探針的理化性質，它決定了激發(fā)與發(fā)射波長、定位目標。目前臨床上常用的熒光探針有吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)和亞甲藍(methylene blue, MB)等[8]。ICG和MB是近紅外區(qū)域的非特異性造影劑，它們不與腫瘤配體結合，但經特定器官代謝。ICG是經FDA批準的熒光染料，其激發(fā)波長為760～810 nm，發(fā)射波長在830 nm左右，處于近紅外波段，具有良好的穿透深度[10]。ICG在體內的半衰期為150～180 s，血管注射后隨血液循環(huán)迅速分布于全身血管內，高效率、選擇地被肝細胞攝取，又從肝細胞以游離形式排泄到膽汁中，經膽管入腸，隨糞便排出體外[11-13]。依據ICG的生物代謝規(guī)律可用于肝臟顯影、肝臟腫瘤定位、膽道顯影、血管造影等。皮下或黏膜下局部注射可經淋巴循環(huán)代謝應用于淋巴管道顯影，定位前哨淋巴結。MB激發(fā)峰在700 nm 左右，主要經由腎臟代謝清除，隨尿液排出，可用于泌尿系統(tǒng)顯影及術后腔內導管的通暢及滲漏測試[12]。

二、熒光成像技術在胰腺癌診療中的應用

1．腫瘤及淋巴結定位：目前術前常用的影像學檢查如CT、MRI等，由于體位的改變、操作者主觀評估及缺乏微小病變敏感度而與術中所見存在一定的差距[14]。而熒光成像技術實時、精準的特性恰好能彌補這一不足。雖然ICG可以很容易識別肝臟腫瘤，因為其通過肝臟清除，對于腹部其他類型的實體腫瘤如胰腺等不具備特異性，但是其可以顯示胰腺腫瘤周圍淋巴結及肝臟微轉移灶。Tummers等[15]通過熒光探針劑量遞增的前瞻性研究評估了在胰腺癌手術后患者中使用西妥昔單抗-IRDye800檢測胰周轉移性淋巴結(lymph nodes, LNs)的可行性。研究共評估了144個LNs，其中低劑量72個，高劑量72個。結果顯示在低劑量(50 mg)隊列中通過熒光成像檢測轉移性LNs效果更好，在組織樣本中靈敏度和特異度分別為100%和78%，在顯微鏡下分別為91%和66%。更重要的是，該方法能夠檢測到直徑<5 mm的隱匿病灶，其靈敏度為88%(15/17 LNs)。另一方面，Yokoyama等[16]對49例術前檢查未發(fā)現(xiàn)肝臟微轉移灶的胰腺癌患者進行了術中熒光成像評估。采用術前靜脈注射ICG，術中使用近紅外成像系統(tǒng)觀察肝臟及組織病理學檢測異常熒光病灶的方法，在13例患者的肝臟內觀察到最大直徑至少1.5 mm的異常熒光信號，但肉眼卻未見明顯腫瘤病灶，其中8例(16%)組織學檢查證實為肝臟微轉移灶。術后6個月復查CT，8例肝臟微轉移患者中7例(88%)發(fā)生明顯的肝臟轉移，而術中未發(fā)現(xiàn)肝臟微轉移的41例患者中4例發(fā)生肝轉移，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Katada等[17]的研究報道，術前檢查未發(fā)現(xiàn)肝轉移的133例胰腺癌中，術中發(fā)現(xiàn)肝臟微轉移20例(15%)，免疫組織化學檢查也提示這20例患者的轉移灶癌細胞均表達CEA。由此可見，以ICG為探針代表的熒光成像可以在術中有效發(fā)現(xiàn)肝臟微轉移病灶。

此外，胰腺的神經內分泌腫瘤，如胰島素瘤，通常難以定位，而完全切除對于疾病治愈至關重要。 Winer等[18]將0.25～2 mg / kg體重的梯度MB注射入荷胰島素瘤鼠體內，通過FLARE熒光成像系統(tǒng)觀察MB檢出病灶的有效性。當注射劑量≥1 mg/kg體重時，MB也會在正常胰腺組織聚集，信背比(signal-to-background ratios, SBR)≥1.6，維持熒光信號長達1 h。同時胰島素瘤與正常胰腺組織的熒光信號比值為3.7，與肌肉的比值為16.2，可見胰島素瘤對MB的攝取比正常胰腺組織更高。 van der Vorst等[19]報道1例神經內分泌瘤患者，術中靜脈注射MB，5 min后SBR值穩(wěn)定在3左右，持續(xù)15 min。胰島素瘤能夠攝取MB產生近紅外熒光信號，可以在術中提供高靈敏度檢測。因此基于MB的熒光成像對胰腺神經內分泌腫瘤術中定位具有一定的優(yōu)勢。

2．胰十二指腸切除術評估：胰十二指腸切除術是胰腺癌手術治療最重要的術式之一，手術質量評估在患者術后轉歸過程中占有非常重要的地位[20]。 Hutteman等[21]對8例接受胰十二指腸切除術的患者在術中靜脈注射ICG，并通過Mini-FLARE近紅外熒光成像系統(tǒng)對胰腺、腫瘤、膽總管和周圍器官進行實時成像。結果未觀察到腫瘤組織與正常胰腺組織的明顯熒光信號差別，但在ICG注射后10 min可清晰看到膽總管熒光顯影，在注射后30～90 min之間具有最大對比度。由于膽汁持續(xù)排泄，可觀察到膽管吻合的通暢性。Rho等[22]也指出，在胰十二指腸切除過程中利用熒光成像產生的視覺差可以為外科醫(yī)師提供非常有效的實時熒光信號，進而指導手術。Hirono等[23]通過ICG熒光成像詳細分析了胰十二指腸切除術患者的淋巴引流途徑，并確定了7條主要的淋巴引流路徑，用以明確胰腺癌手術淋巴結清掃范圍。20例患者中4例(20%)觀察到腸系膜上動脈左側的淋巴途徑，17例(85%)觀察到主動脈區(qū)域，且到達腸系膜上動脈周圍的平均時間比到達主動脈區(qū)域的時間更長。

三、胰腺癌熒光探針的研發(fā)

1．ICG改良探針：ICG作為經FDA批準的最常用的熒光染料之一，因其經肝臟代謝而對胰腺腫瘤原發(fā)病灶不具有特異性，限制了其應用，所以很多學者在ICG生物學特性的基礎上進行優(yōu)化，研發(fā)了一系列ICG改良探針。Qi等[24]將透明質酸衍生的納米顆粒與ICG綴合形成NanoICG用于胰腺癌的術中近紅外熒光檢測。NanoICG對正常胰腺上皮細胞無細胞毒性，沒有誘導趨化或吞噬作用，且在原位胰腺癌模型內明顯聚集，使胰腺病灶的熒光強度較胰腺非病變部分顯著增強，也較單純ICG聚集胰腺病變部位的熒光強度更高。Aung等[25]將大鼠IgG2b抗組織因子(抗-TF)單克隆抗體1849(抗-TF1849)標記至ICG，合成了抗-TF 1849-ICG綴合物，通過蛋白質印跡法觀察BxPC-3細胞TF表達量，結果與通過熒光顯微鏡觀察到的優(yōu)先結合1849-ICG的細胞內定位一致，說明這種1849-ICG綴合物可用于治療高表達TF的胰腺癌，為胰腺癌治療提供了新的策略。

2．其他新型探針：Neesse等[26]研究了花青染料(Cy5.5)標記的緊密連接蛋白-4與產氣莢膜梭菌腸毒素耦聯(lián)的無毒C端片段(C-CPE-Cy5.5)在胰腺癌動物模型中的定位診斷效果。通過與熒光成像方法結合，實現(xiàn)了緊密連接蛋白-4陽性小鼠胰腺腫瘤及其前驅病變的無創(chuàng)可視化，探索了一種新型的早期診斷模式。Park等[27]制備了熒光團共軛的胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)抗體，可以標記顯示胰腺癌細胞膜上的熒光灶，進而實現(xiàn)術中胰腺腫瘤病灶的定位。 Hoogstins等[28]研發(fā)了一種新型熒光標記的抗CEA抗體，即SGM-101。術前注射SGM-101，術中發(fā)現(xiàn)其特異性地聚集在表達CEA的原發(fā)性腫瘤、腹膜及肝轉移病灶中，原發(fā)病灶SBR為1.6，轉移性病變SBR為1.7，表明使用熒光標記的抗CEA抗體對于術中檢測原發(fā)性胰腺癌病灶和轉移瘤是安全有效的。

四、總結和展望

熒光成像作為一種新型的診斷方法，可以使用具有高靈敏度和空間分辨率的熒光探針，使探針劑量最小化并允許實時確定組織狀態(tài)[29-30]。這種方法已經在腫瘤定位診斷、前哨淋巴結顯影、組織灌注等方面發(fā)揮了巨大的優(yōu)勢。熒光成像作為胰腺癌術中檢測的新型又精準的方法，可以使惡變組織切除最大化。目前臨床使用的ICG和MB分別經過肝臟或腎臟代謝，隨膽汁或尿液排出體外，對于胰腺癌的診斷不具有特異性，但其能夠清楚顯示病灶周圍淋巴結及肝微轉移病灶，而且能夠為胰十二指腸切除術提供一種評估方法，在一定程度上有助于胰腺癌術中診斷及治療。盡管目前能夠使用的熒光探針非常有限，且缺乏胰腺癌特異性，但隨著眾多學者對基于ICG耦合的探針改良和新型探針的研發(fā)，這些探針對于胰腺癌早期診斷、術中定位更具有特異性。隨著熒光成像技術的不斷發(fā)展，其在胰腺癌的診斷與治療中會展現(xiàn)出更廣闊的前景，也對提升患者預后起到積極的推動作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突