吳 振 詹 永 李 紅 楊 勇 譚紅軍 黃小平 王海燕

(1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401123；3. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

山銀花富含粗多糖、有機(jī)酸類、黃酮類、三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類及微量元素等活性成分，特別是綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸等活性成分含量較高，其綠原酸和總皂苷含量一般高于金銀花[1-3]。研究表明，山銀花及其提取物具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、改善肝功能[6]等生理活性。目前，山銀花的研究主要集中在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[7]、產(chǎn)地差異[8-9]、初加工差異[10-11]、藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性[4]等方面，而關(guān)于其深加工及產(chǎn)品研發(fā)等方面則未見報(bào)道。

山銀花作為重要的原料，在制劑、保健食品、化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。一般采用山銀花提取物或者浸膏居多[12-13]，但本課題組研究發(fā)現(xiàn)，山銀花超微粉(全粉)對(duì)二甲苯致KM小鼠耳腫脹具有非常好的抗炎作用(需進(jìn)一步探討揭示其機(jī)理)。超微粉碎是近年來食品原料學(xué)、生物技術(shù)、制劑及材料學(xué)方面的一項(xiàng)新技術(shù)，利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法克服固體內(nèi)部凝聚力使之破碎(達(dá)到100 μm以下)；食品原料超微粉碎后其營養(yǎng)成分、理化性能、功能活性及加工性能等方面均得到改善，不僅提高了物料粉體的溶解性、分散性、吸附性、化學(xué)反應(yīng)活性等，甚至還可以將植物的不可食部分(如粗纖維等大分子)通過超微化被人體吸收，賦予產(chǎn)品細(xì)膩的口感[14-15]；食品原料的超微粉碎帶給它們更多獨(dú)特性能，將成為食品資源開發(fā)的重要手段和主流發(fā)展方向。國內(nèi)外研究[14-15]均表明，超微粉碎是一種將物料轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谏镛D(zhuǎn)化和水解的方法。盡管如此，未見有關(guān)超微粉碎對(duì)山銀花影響的報(bào)道。因此，本研究擬通過對(duì)山銀花進(jìn)行不同粉碎(即普通粉碎和超微粉碎)，比較其微粒結(jié)構(gòu)、活性成分(綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等)含量、綠原酸溶出率和清除DPPH自由基(DPPH·)的差異，以期為山銀花的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山銀花：忍冬科灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand. Mazz.)，采集于重慶秀山；

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)：純度≥98%，美國Sigma-Aldrich公司；

溴化鉀：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品：HPLC≥98%，中國藥品生物制品檢定所；

其他化學(xué)試劑：國產(chǎn)分析純；

所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

三孔電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司；

多功能粉碎機(jī)：GX-04型，上海遠(yuǎn)翔食品機(jī)械有限公司；

高頻振動(dòng)式超微粉碎機(jī)：WZJ6型，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司；

激光粒度儀：Mastersizer 2000型，英國馬爾文malvern儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum GX型，美國Perkin-Elmer公司；

中紅外DTGS檢測器：ALPAAI-4LSC型，美國Christ公司；

HPLC儀：2690-2995型，配蒸發(fā)光散射檢測器，美國Waters公司；

電子天平：CP-224S型，德國賽多利斯集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 普通粉碎和超微粉碎山銀花 原料清洗、去除雜質(zhì)、干燥(時(shí)間24 h，55 ℃)；中藥粉碎機(jī)或超微粉碎(時(shí)間20 min)，過60目篩。

1.2.2 傅立葉變換中紅外光譜(FT-IR)、掃描電鏡(SEM)和粒徑分析方法

(1) FT-IR：采用溴化鉀壓片法。準(zhǔn)確取0.30 g溴化鉀(色譜純)和0.03 g樣品粉末混勻后進(jìn)行壓片；條件為壓力27 MPa，時(shí)間1 min；檢測條件：DTGS檢測器，光譜分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～450 cm-1；采用傅立葉變換中紅外光譜儀自帶的操作軟件采集及處理紅外圖譜。

(2) SEM：采用戊二醛將待測樣品進(jìn)行固定，再用離子濺射儀對(duì)樣品表面進(jìn)行鍍金，將其置于掃描電鏡下觀測形態(tài)，加速電壓為10 kV。

(3) 粒徑：采用激光粒度儀分別對(duì)山銀花超微粉和普通細(xì)粉末樣品進(jìn)行粒度測定。

1.2.3 山銀花有效活性成分分析 綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙含量測定參照文獻(xiàn)[16]30；木犀草苷、咖啡酸含量測定參照文獻(xiàn)[16]221。

1.2.4 山銀花超微粉和普通粉中綠原酸的溶出度測定 采用槳法[17]。分別準(zhǔn)確稱取山銀花超微粉和普通粉30 g，投入溶出儀中，避免產(chǎn)生氣泡，以超聲脫氣的900 mL超純水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度為(37.0±0.5) ℃，立即啟動(dòng)儀器，計(jì)時(shí)；分別于5，15，30，45，60 min各取樣2 mL，過0.45 μm 濾膜，得到以超純水為溶出介質(zhì)的供試品溶液，HPLC測定綠原酸含量，同時(shí)向杯中補(bǔ)充相同溫度和體積的超純水，計(jì)算累計(jì)溶出率。

1.2.5 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花清除DPPH·能力的影響測定 準(zhǔn)確稱取山銀花超微粉(LMUFP)、普通細(xì)粉(LMCP)各10.00 g，分別加入去離子水50 mL，混合均勻后置于50 ℃水浴中超聲波提取2 h，過濾，濾渣用同樣的方法提取1 h，混合2次濾液并蒸發(fā)濃縮，離心(5 000 r/min，5 min)后定容至100 mL，即得到100 mg/mL的樣品提取液，放置冰箱備用。按照Liu等[18]方法并略有修改，將不同濃度(10～50 mg/mL)的樣品提取物溶液3.0 mL與DPPH· 溶液1.0 mL(95%乙醇中配置，濃度為10-4moL/L)混勻后，于波長517 nm處測定吸光度(Ai)，同時(shí)，將DPPH·溶液1.0 mL 與樣品空白3.0 mL混勻后測定吸光度(Ac)，將不同濃度的樣品提取物溶液3.0 mL與95%乙醇溶液1.0 mL混勻后測定吸光度(Aj)，按式(1)計(jì)算DPPH·清除率：

(1)

式中：

s——DPPH·清除率，%；

Ai——樣品液組吸光度；

Aj——DPPH·空白組吸光度；

Ac——樣品空白組吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 15數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示，并進(jìn)行方差分析，最小顯著性差異檢驗(yàn)(LSD)進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花的顆粒結(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)的影響

山銀花超微粉和細(xì)粉的FT-IR圖譜如圖1所示，二者非常相似，表明超微粉碎對(duì)山銀花中各組分主要官能團(tuán)及活性成分的結(jié)構(gòu)影響較??；但與山銀花細(xì)粉相比，超微粉在3 407，2 919，2 360，1 629，1 047 cm-1等處的吸收峰均增強(qiáng)，說明粗多糖及纖維類特征吸收峰增強(qiáng)，可能是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等大分子受到劇烈機(jī)械力作用，發(fā)生分子鏈斷裂現(xiàn)象，分子聚合度有減小趨勢，更多葡萄糖苷鍵、氫鍵等基團(tuán)暴露；也可能是超微粉碎后粉體粒徑減小，相同條件下顆粒數(shù)目相對(duì)增多，暴露出更多的親水基團(tuán)，使其吸收峰增強(qiáng)[19]。

A. 細(xì)粉 B. 超微粉

山銀花超微粉和細(xì)粉的掃描電鏡(SEM)如圖2所示。山銀花細(xì)粉形狀各異，粒徑較大，表面較粗糙。經(jīng)過超微粉碎后，山銀花原片狀結(jié)構(gòu)被切斷，呈現(xiàn)粒徑較小、形狀多為圓錐形或束形、纖維單個(gè)散在或數(shù)個(gè)成束的微粒結(jié)構(gòu)特性。由圖3可知，經(jīng)過普通粉碎的山銀花顆粒分布范圍較廣，平均粒徑為3 368 nm(分散系數(shù)PDI為0.817)，經(jīng)過超微粉碎的山銀花顆粒平均粒徑為535.5 nm(分散系數(shù)PDI為0.540)?？梢?，經(jīng)過超微粉碎后，其粒徑分布區(qū)域變窄。研究發(fā)現(xiàn)，超微粉碎通過剪切力改變了物料大小，未有效改變纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，只是改變纖維的顆粒大小[20]。經(jīng)超微粉碎后，粒徑減小，同時(shí)粉碎過程中纖維等大分子長鏈發(fā)生斷裂，使得羧基、羥基等基團(tuán)充分暴露出來，從而改善其物化特性。

2.2 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花的有效活性成分含量的影響

山銀花超微粉和細(xì)粉的綠原酸、總皂苷(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙)、木犀草苷、咖啡酸等有效活性成分含量見圖4；其中山銀花超微粉的綠原酸、總皂苷和咖啡酸含量顯著高于細(xì)粉(P<0.05)的；木犀草苷含量無顯著性差異。結(jié)果顯示，超微粉碎處理促進(jìn)山銀花活性成分溶出。化學(xué)成分是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，研究如何提高活性成分含量能夠更好地指導(dǎo)山銀花的綜合利用和成分提取[5-6]。Xiao等[21]研究發(fā)現(xiàn)超微粉碎可以提高茶葉粉中水溶性成分茶多酚、咖啡堿、多糖的含量，并認(rèn)為是由于超微粉的粒徑減小，導(dǎo)致細(xì)胞壁破損率增加而提高了水溶性成分的溶出。

圖2 山銀花粉的掃描電鏡(SEM)

圖3 普通粗碎與超微粉碎對(duì)山銀花粉末粒徑的影響

*. 超微粉與細(xì)粉的活性成分之間差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Effect of ultrafine and common grinding on the contents of effective compositions ofL.macranthoides

2.3 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花中綠原酸溶出度的影響

以蒸餾水為溶出介質(zhì)，累計(jì)溶出量與測定的綠原酸含量之比即為累計(jì)溶出率。山銀花超微粉和細(xì)粉溶出數(shù)據(jù)見圖5，結(jié)果表明超微粉中綠原酸的溶出度和溶出速率與細(xì)粉相比均具有較明顯的優(yōu)勢，原因主要?dú)w結(jié)于超微粉具有良好的粒徑、比表面積和顆?？紫斗植?，超微顆粒的微觀結(jié)構(gòu)變化影響了提取過程中植物化學(xué)物質(zhì)的擴(kuò)散過程，導(dǎo)致水提取物中可提取的小分子活性成分含量增加，從而提高了溶出量[22]。

2.4 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花抗氧化活性的影響

山銀花超微粉和細(xì)粉清除DPPH·能力對(duì)比如圖6所示。LMCP和LMUFP清除DPPH·能力都隨著質(zhì)量濃度的增加而明顯增強(qiáng)，均呈劑量效應(yīng)關(guān)系；LMUFP對(duì)DPPH·的清除作用要好于LMCP，尤其是在濃度增大時(shí)；超微粉清除DPPH·的能力是細(xì)粉的1.36倍(濃度均為60 mg/mL時(shí))，說明山銀花超微粉抗氧化作用顯著高于細(xì)粉，與有效成分含量結(jié)果一致；原因可能是：① 超微粉碎破壞了原微粒的網(wǎng)狀致密結(jié)構(gòu)，暴露出更多的親水基團(tuán)，導(dǎo)致親水性增加，其清除DPPH·能力隨之提高[22]，這與FT-IR和SEM表征分析結(jié)果一致，均證實(shí)了超微粉碎對(duì)山銀花微粒結(jié)構(gòu)的破壞作用[23]；② 超微粉碎破壞了山銀花的細(xì)胞壁及其內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成更多的可溶性小分子活性成分溶出[24]，這與“2.2和2.3部分”的活性成分含量及其溶出數(shù)據(jù)一致。此外，傳統(tǒng)山銀花提取物或浸膏均采用高溫處理，而超微粉碎全過程均處于低溫狀態(tài)，有效防止了熱敏性成分及多酚的氧化和降解，具有更廣泛的應(yīng)用前景。

圖5 山銀花超微粉和普通細(xì)粉中綠原酸的溶出曲線

Figure 5 The dissolution curve of chlorogenic acid of ultrafine and common grinding ofL.macranthoides

圖6 超微粉碎和普通粉碎對(duì)山銀花清除DPPH·能力的影響

Figure 6 Effect of ultrafine and common grinding on the DPPH· scavenging activity ofL.macranthoides

3 結(jié)論

超微粉碎使山銀花藥材的微粒結(jié)構(gòu)(細(xì)胞壁及粗纖維結(jié)構(gòu))改變，提高了綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等活性成分的溶出量及溶出速率，所以提高了其清除DPPH·的能力。通過山銀花粉末微粒結(jié)構(gòu)結(jié)合活性成分及抗氧化能力評(píng)價(jià)，揭示了超微粉碎對(duì)山銀花全粉的影響，對(duì)山銀花的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)具有指導(dǎo)意義。目前山銀花的研究仍側(cè)重于化學(xué)成分與藥理作用的研究，將來研究的重點(diǎn)是開展山銀花系統(tǒng)研究，針對(duì)基原、不同產(chǎn)地、不同加工方法和產(chǎn)品研發(fā)及其綜合利用進(jìn)行研究。因此，山銀花直接超微粉碎作為一種營養(yǎng)補(bǔ)充劑，替代山銀花提取物或者浸膏，在活性成分富集、抗氧化能力增強(qiáng)等方面具有較好的應(yīng)用前景。