王婷婷，宋 星，李 燕

（上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306）

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是地球上最為豐富的可再生資源，其在纖維素酶的催化下可降解為單糖，進(jìn)而可以發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、菌體蛋白等有用物質(zhì)，所以它的利用和轉(zhuǎn)化對(duì)于人類而言意義重大[1-2]。

纖維素酶是世界上第三大工業(yè)酶，在食品、釀酒、造紙、紡織、飼料、中藥提取等產(chǎn)業(yè)中均有較為廣泛的應(yīng)用[3-5]。纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶系，包括多種水解酶，一般認(rèn)為主要包括3類具有協(xié)同作用的酶組分，即內(nèi)切型葡聚糖苷酶、外切型葡聚糖苷酶和纖維二糖酶[6]。纖維素酶主要來(lái)源于微生物，然而纖維素酶生產(chǎn)菌產(chǎn)酶能力低下、Km值較大且酶系組分不均衡等問題，大大限制了纖維素酶的應(yīng)用[7-8]。因此獲得一種活力高且穩(wěn)定的纖維素酶，成為該領(lǐng)域最關(guān)鍵的問題。近些年來(lái)，動(dòng)物源纖維素酶越來(lái)越受到關(guān)注，研究者們?cè)谥参铩?dòng)物包括（貽貝、白蟻、海膽、福壽螺、松線蟲、蚯蚓，小龍蝦等）中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)源纖維素酶的存在[9-11]。這為纖維素酶的應(yīng)用提供了重要的纖維素酶基因來(lái)源，因此動(dòng)物纖維素酶的研究具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

文蛤是一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，在水中主要以浮游植物為食，所以可能體內(nèi)含有纖維素酶，值得對(duì)其進(jìn)行探究。作者利用均質(zhì)、鹽析、透析、離子層析和疏水層析等技術(shù)，首次從文蛤中分離純化出一種內(nèi)切纖維素酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 文蛤：購(gòu)于上海浦東新區(qū)泥城鎮(zhèn)大潤(rùn)發(fā)超市。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Thermo Fisher scientific公司；SS250-E組織搗碎機(jī)：方勝電器實(shí)業(yè)有限公司；UNICO UV-2000紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑 DEAE Sepharose Fast Flow、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow層析填料：美國(guó)GE Healthcare公司；低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：上海國(guó)藥集團(tuán)；DNS 試劑（3，5-二硝基水楊酸）：國(guó)藥；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 CMC-Na酶活測(cè)定方法 取1 mL的酶液于45℃水浴預(yù)熱3 min，加入已預(yù)熱的1%CMC-Na溶液 （由pH 5.0、0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）1.0 mL，混勻，45℃反應(yīng) 30 min，立即加入 1 mL的2.0 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。取上述混合液1 mL，加入1.5 mL的DNS試劑，沸水浴中顯色5 min，流水冷卻后定容至25 mL，測(cè)定其在490 nm處的吸光度值（OD490）。CMC-Na酶活定義：將每分鐘生成相當(dāng)于1 μg葡萄糖的還原糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.2.2 蛋白質(zhì)測(cè)定方法 蛋白含量測(cè)定采用Lowry法[12]和紫外分光光度法測(cè)定。

1.2.3 粗酶液制備 文蛤于冰上去殼，取內(nèi)容物，以 1∶3質(zhì)量體積比與 pH 4.8、0.025 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，用組織搗碎機(jī)搗碎，置于4℃提取4 h，10 000 r/min離心30 min，得上清液即為粗酶液。

1.2.4 纖維素酶的純化

1）硫酸銨分級(jí)沉淀：分別取粗酶液10 mL，分裝至9支試管中，在冰浴條件下慢慢加入硫酸銨固體，使9支試管的硫酸銨飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。 4℃靜置過夜，冷凍離心，分別測(cè)上清液中剩余酶的活性，由此確定最佳硫酸銨分級(jí)沉淀?xiàng)l件。

2）DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析：硫酸銨分級(jí)沉淀所得酶液經(jīng)透析除鹽，上樣于已用pH 8.1、25 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱（1 cm×24 cm）。采用梯度洗脫，先后分別用含0.05、0.3 mol/L的NaCl的緩沖液洗脫，流速1 mL/min，每3 min收集一管。測(cè)定每管的酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集有酶活的洗脫峰。

3）苯基低取代疏水層析：離子層析所得酶液加入硫酸銨使其最終濃度為1 mol/L，過0.45 μm濾膜得清液上樣于苯基疏水層析柱（1.6 cm×20 cm）。先用含1 mol/L硫酸銨的pH 7.5、25 mmol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫不結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后分別用含0.5、0 mol/L硫酸銨的 25 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速為1 mL/min，3 min收集一管。檢測(cè)洗脫液的蛋白質(zhì)含量和酶活力，繪制洗脫圖譜，合并活力峰。

4）SDS-PAGE：用SDS-PAGE測(cè)定酶分子亞基相對(duì)分子質(zhì)量。采用4%的濃縮膠，12%的分離膠，濃縮膠穩(wěn)流是10 mA，分離膠穩(wěn)流20 mA，電泳結(jié)束以后用1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（14 400～97 400）作為參照。

1.2.5 文蛤纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)

1）最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定：在40℃恒溫下，pH 3～8緩沖體系中測(cè)定相應(yīng)的酶活力。以酶活力對(duì)pH作圖，探討pH對(duì)酶活的影響。

pH穩(wěn)定性試驗(yàn)：酶液與等量不同pH的緩沖溶液混合，置于4℃下孵育20 h后測(cè)定酶活力。

2）最適溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定：在pH 5.2的緩沖體系中，在10～70℃范圍內(nèi)，探究溫度與酶活力的關(guān)系。

酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將酶液放置在不同溫度中孵育1 h，迅速冷卻到室溫，45℃測(cè)定剩余酶活力。

3）酶催化CMC-Na水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km的測(cè)定：在最適反應(yīng)條件下，改變底物（CMC-Na）的濃度[s]，測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度v0，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，以1/v對(duì)1/[s]作圖，從直線的截距求得該酶催化CMC-Na水解的米氏常數(shù)Km和最大速度Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨飽和度區(qū)間確定 由圖1可知：硫酸銨飽和度在0~20%之間，上清液中的纖維素酶活力基本不變，但蛋白質(zhì)含量一直在減少，說明絕大多數(shù)的酶仍在上清液中，沉淀了一部分的雜蛋白質(zhì)；當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)到70%時(shí)，上清液中的酶活力基本不再減少，說明大部分的酶已經(jīng)被沉淀了，剩余的基本大多是雜蛋白質(zhì)了。綜合酶活和回收率兩方面考慮，收集20%~70%的纖維素酶沉淀，將沉淀復(fù)溶解后置于透析袋中，4℃透析過夜。

圖1 硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果Fig.1 Results of ammonium sulfate precipitation

2.1.2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析由圖2可以看出，洗脫過程共出現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)峰，經(jīng)酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)峰Ⅱ蛋白質(zhì)含量最低，但酶活力最高，而峰Ⅲ雖有酶活性但比活力較低，故只收集峰Ⅱ組分，除掉了大量雜蛋白質(zhì)，有利于下一步的分離純化。

2.1.3 Phenyl-Sepharose疏水層析 從圖3可以看出，第四個(gè)蛋白質(zhì)峰酶活力高，蛋白質(zhì)含量低，蛋白質(zhì)的比活力較高，而峰1和峰3中雖然存在酶活性，但比酶活極低，故收集峰4的酶液，進(jìn)一步通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度。

圖2 文蛤纖維素酶經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫圖譜Fig.2 DEAE-FF column chromatography of cellulase from Meretrix meretrix L

圖3 Phenyl Sepharose疏水作用層析洗脫圖譜Fig.3 Phenyl sepharose column chromatography

2.2 純化結(jié)果

2.2.1 SDS-PAGE結(jié)果 用SDS-PAGE對(duì)各純化階段所得酶液進(jìn)行純度分析，結(jié)果見圖4。由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgMw與其遷移率Rf的線性關(guān)系，求得文蛤纖維素酶的亞基相對(duì)分子質(zhì)量為59 700。孫長(zhǎng)樂[13]等從九孔鮑中提取到的纖維素酶的相對(duì)分子質(zhì)量為55 000；日本海膽[14]纖維素酶的相對(duì)分子質(zhì)量為54 000；從小龍蝦[15]中分離到的兩種纖維素酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別為47 800與50 300。從福壽螺[16]中分離到的纖維素酶的相對(duì)分子質(zhì)量為42 000，從貽貝[17]中提取到的纖維素酶相對(duì)分子質(zhì)量更小，僅為 19 700，可見纖維素酶的分子質(zhì)量大小會(huì)因種族及其生活環(huán)境差異而各不相同。

圖4 純化過程的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of Cellulase from Meretrix meretrix L

2.2.2 文蛤纖維素酶純化結(jié)果 從表1可以看出，作者對(duì)文蛤纖維素酶進(jìn)行了3步純化：硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-陰離子交換層析、苯基疏水層析后，最終纖維素酶的純化倍數(shù)為13.12倍，其比活力為40 330 U/g，回收率為4.82%。其中，硫酸銨沉淀步驟的純化倍數(shù)很低，可能是由于為了避免在初步分離純化階段目標(biāo)酶的損失，選擇的沉淀區(qū)間較寬造成的。DEAE-陰離子交換層析的純化效果比鹽析略好，回收率很低，結(jié)合圖4分析，離子交換層析雖去掉了大量的雜蛋白質(zhì)，但可能因?yàn)閷游龅木彌_環(huán)境（pH 8.1）遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離最適pH，所以酶活力損失較大。

表1 文蛤纖維素酶的純化結(jié)果（以CMC-Na酶活表示）Table 1 Purification of Meretrix meretrix L cellulose（CMCase）

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 在pH 2.6~8范圍內(nèi)，文蛤纖維素酶的最適反應(yīng)pH為5.2，緩沖液pH對(duì)纖維素酶活有顯著影響，見圖5。pH在4以下和9以上極不穩(wěn)定，酶活力損失嚴(yán)重，剩余酶活力不到20%。在pH 4～6范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，于4℃靜置24 h后相對(duì)酶活力仍在70%以上，見圖6。

2.3.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 在10～45℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，文蛤纖維素酶活力升高，45℃以后酶活力逐漸降低，所以最適反應(yīng)溫度為45℃，見圖7。由圖8可知，在4~50℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，剩余酶活力都在80%以上。高于此溫度，酶活力迅速下降，在60℃保溫1 h相對(duì)酶活力僅剩余27.7%，在70℃保溫1 h，僅剩14%的酶活力，熱穩(wěn)定性差。

圖6 文蛤纖維素酶的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of the EGase from Meretrix meretrix L

圖5pH對(duì)酶催化CMC-Na活力的影響Fig.5 Effect of pH on cellulase activity

圖7 溫度對(duì)酶催化CMC-Na活力的影響Fig.7 Effect of temperature on cellulase activity

圖8 文蛤纖維素酶的溫度穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of the cellulase from Meretrixmeretrix L

2.3.3動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax由圖9得到的雙倒數(shù)方程為y=0.340 6x+12.64，從而計(jì)算出以CMCNa為底物，文蛤纖維素酶的Km值為0.111 mmol/L，Vmax為 0.327 mmol/（L·min）。賀剛[18]等從草魚腸道篩選出一個(gè)產(chǎn)纖維素酶的菌株，其Km值為4.212 mmol/L；胡亞東[19]等從參環(huán)毛蚯蚓中分離出的能降解CMC-Na的纖維素酶的Km值為1.193 mmol/L；朱文青[20]等人從里氏木霉發(fā)酵液分離純化出兩種纖維素酶，以CMC-Na為底物時(shí)，其Km值分別為9.085、13.958 mmol/L。相比較而言，本研究純化所得的纖維素酶的Km值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上述文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)，所以該酶較其他來(lái)源的纖維素酶有更好的水解纖維素的能力，這為尋求高活力的工業(yè)纖維素酶提供了良好的基因來(lái)源。

3 結(jié) 語(yǔ)

圖9 pH 5.2的測(cè)活體系下，纖維素酶催化CMC-Na水解反應(yīng)的雙倒數(shù)圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot for determination of Kmat pH 5.2

文蛤纖維素酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、DEAE Sepharose FF陰離子交換層析、苯基疏水層析分離純化后，得到一種相對(duì)分子質(zhì)量為59 700的纖維素酶組分。比活力由3.07 U/mL增加到40.33 U/mL，純化效果顯著，純化倍數(shù)為13.12，回收率為4.82%。該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為5.2，該酶在50℃以下和pH 4.0～7.0之間穩(wěn)定性好。以CMC-Na為底物時(shí)的Km值為0.111 mmol/L。作者分離所得的纖維素酶Km值較小，對(duì)底物的親和性較高，可以為工業(yè)纖維素酶提供較好的基因來(lái)源。此外，分離的主要是內(nèi)切纖維素酶組分，可能文蛤中還存在同工酶或其他纖維素酶組分，有待進(jìn)一步的研究和探索。