蘆文娟， 李寶坤， 盧士玲， 李開雄， 王曉雯， 杜紫萱

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

原料乳營(yíng)養(yǎng)豐富，適宜人類食用，但其較高的水分含量和接近中性的pH值也非常適合細(xì)菌、酵母菌、霉菌等各種微生物的生長(zhǎng)和繁殖[1]。這些菌群有的可以使乳及乳制品產(chǎn)生理想風(fēng)味，有的則會(huì)引起乳及乳制品的腐敗變質(zhì)，甚至使人類產(chǎn)生疾病[2]。其中當(dāng)屬乳源酵母菌最為典型。

原料乳中的酵母菌是乳制品中酵母菌的主要來(lái)源之一，很多乳制品均以原料乳為原料加工而成，其中的酵母菌賦予了產(chǎn)品特殊風(fēng)味和提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。20世紀(jì)初，研究學(xué)者認(rèn)為酵母菌僅作為一種腐敗菌存在于原料乳中，使乳制品品質(zhì)下降如出現(xiàn)產(chǎn)氣、酵母味或其他異味、變色和引起質(zhì)構(gòu)變化等[4-6]，故對(duì)原料乳中的酵母菌研究較少。近年來(lái)，全球乳業(yè)迅速發(fā)展，科研人員把重點(diǎn)集中在酵母菌在乳制品中的有益作用方面，不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對(duì)乳制品風(fēng)味的影響、抑制有害菌及對(duì)人體的益生作用[7-8]，如：預(yù)防和治療急性痢疾、降低膽固醇、抗輻射和抗氧化等[9]。因此，從原料乳中篩選出有益酵母菌，并應(yīng)用于乳制品中具有重要意義。

然而各種自然環(huán)境的差異使得微生物資源存在差異，作者將首次對(duì)塔城周邊游牧地區(qū)原料乳中的酵母菌進(jìn)行研究，運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離篩選酵母菌，并進(jìn)行生理生化鑒定和5.8S rDNA-ITS分子生物學(xué)鑒定，對(duì)原料乳中酵母菌的分布和種類的多樣性進(jìn)行分析，為后人研究本地區(qū)原料乳中微生物菌群提供基礎(chǔ)資料，并對(duì)后續(xù)篩選具有潛在益生功能的酵母菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 新疆塔城地區(qū)原料乳：采自新疆塔城喀拉也木勒、烏宗布拉克、二道橋牧場(chǎng)等地。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種的分離使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），純化和保存使用酵母膏胨葡萄糖瓊脂（YEPD）平板和斜面培養(yǎng)基。

鑒定使用Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)酯培養(yǎng)基、產(chǎn)類淀粉培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），2xTaq PCR MasterMix：均由天根生化科技有限公司提供；GoldView核酸染色劑；引物ITS1和ITS4：由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

主要儀器：超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272）、高速冷凍離心機(jī)（5417R）、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 （LD2X-30KA）、普通光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS COVER-015）、PCR 擴(kuò)增儀（TC-512）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 取1 g樣品，溶于9 mL無(wú)菌水中，充分振蕩使其混勻后置于25℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1 h后吸取1 mL接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）中進(jìn)行活化，25℃培養(yǎng)36 h?；罨缶瓴扇∠♂尫ㄍ坑赑DA培養(yǎng)基進(jìn)行分離，平板置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落特征并挑取不同形態(tài)單菌落，進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，將類似酵母菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)幾次純化酵母菌，直至鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于YEPD斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)36 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酵母菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 將上述純培養(yǎng)菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)36 h后，挑選單個(gè)菌落觀察其形狀、色澤、光滑度、透明度、邊緣整齊度和隆起程度等特征；并選擇具有代表性的菌株，置于顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

1.2.3 酵母菌的理化性質(zhì)鑒定 酵母菌分離株的生理生化特征主要是對(duì)其繁殖方式、子囊孢子、擲孢子、菌絲等進(jìn)行觀察、并通過(guò)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、類淀粉化合物生成實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定[10-11]。

1.2.4 酵母菌的5.8S rDNA分析

1）酵母菌基因組DNA的提?。簩⑸鲜黾兓慕湍妇臃N于YPD液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)36 h，取1 mL活化菌懸液，按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說(shuō)明書上方法進(jìn)行操作，將所提取的DNA于-20℃保存。

2）PCR 擴(kuò)增（5.8S rDNA-ITS 片段擴(kuò)增）：將上述制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，使用引物 ITS 1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3’）和ITS 4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[12]對(duì)5.8S-ITS區(qū)域酵母菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增；采用50 μL反應(yīng)體系：DNA 模板 2 μL，ITS 1（10 μmol/L） 2 μL，ITS 4 （10 μmol/L）2 μL，2xTaq PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)35次；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。電泳后，用GoldView染色20 min，紫外燈下觀察，拍照。

3）擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)合格后，送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的5.8S rDNA基因序列，采用軟件Mega5.0中的Neighbor-Joining方法與標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離結(jié)果

采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法，從采集的7份原料乳樣品中，共得到33株酵母菌，結(jié)果見表1。

2.2 酵母菌的形態(tài)鑒定結(jié)果

酵母菌在經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后，觀察菌落形態(tài)和在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。酵母菌菌落形態(tài)呈圓形或橢圓形，乳白色或淡黃色，表面光滑或干燥，邊緣整齊，表面凸起，呈現(xiàn)半透明狀或不透明。細(xì)胞形態(tài)為圓、橢圓、卵圓等，繁殖方式多為無(wú)性繁殖，且無(wú)菌絲或有假菌絲，細(xì)胞形態(tài)符合酵母菌特征。酵母菌的菌落形態(tài)結(jié)果見表2，細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式見表3。

表1 采樣點(diǎn)及分離酵母菌株編號(hào)Table 1 Sample and Isolation of yeasts number

表2 酵母菌的菌落形態(tài)結(jié)果Table 2 Yeast colony morphology results

續(xù)表2

表3 酵母菌細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式Table 3 Yeast cell morphology and reproductive modes

2.3 酵母菌的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果

依據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)分離株均為芽殖，有些有假菌絲，在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中除葡萄糖發(fā)酵外不發(fā)酵其他被檢糖，在碳源同化實(shí)驗(yàn)中可同化乙醇和檸檬酸，氮源同化實(shí)驗(yàn)中不能同化硝酸鹽，屬于畢赤氏酵母屬；部分分離株如分離株5-3、5-4、6-5，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原、類淀粉物質(zhì)的生成試驗(yàn)陰性，歸為梅奇酵母屬；還有部分菌株僅依據(jù)生理生化鑒定結(jié)果，無(wú)法對(duì)其種屬進(jìn)行判斷。酵母菌的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果見表4，碳源、氮源同化鑒定結(jié)果見表5。

2.4 酵母菌的5.8S rDNA鑒定

2.4.1 酵母菌株5.8S rDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)酵母菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在450~750 bp之間獲得特異性擴(kuò)增條帶，符合酵母菌5.8S rDNA區(qū)理論預(yù)期值，檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表4 酵母菌的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical properties of yeasts

表5 碳源、氮源同化鑒定結(jié)果Table 5 Carbon assimilation and nitrogen assimilation experiment results

續(xù)表5

圖1 酵母菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products from yeasts

2.4.2 基于5.8S rDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 酵母菌序列經(jīng)過(guò)在NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列搜索，比較分離出的酵母菌菌株與已知酵母菌菌株相應(yīng)序列的相似程度，總結(jié)33株分離酵母菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果見表6。

表6 33株酵母菌的ITS序列鑒定結(jié)果Table 6 ITS sequence of 33 strains yeast identification results

從中挑選出生長(zhǎng)較為旺盛、生理生化特征典型、具有代表性的17個(gè)分離株的序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列做系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，基于ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

由圖2可知，分離株1-4與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性為93%，根據(jù)酵母菌種類的劃分依據(jù)，同源性低于98%的，不能歸為同一個(gè)種[13]，因此對(duì)于菌株1-4的種類有待進(jìn)一步驗(yàn)證。其余所有分離菌株與之對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在98%及以上，并與之聚在一起，表明其具有較近的親緣性。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

3 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)新疆塔城地區(qū)原料乳中的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，從采集的7份樣品中，經(jīng)過(guò)菌種的分離純化，共得到33株酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)和對(duì)5.8S ITS區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增相結(jié)合的方法成功的將其鑒定到種。其中，菌株1-4單孢釀酒酵母（Kazachstania unispora）；菌株 3-2、3-3 為發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）；菌株 3-5、3-6為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）；菌株3-8、7-1為馬克思克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）；菌株 4-2、6-2 為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）； 菌株 5-3、5-4、6-5 為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌株 5-6 為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；其余全部為庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

綜上看來(lái)，同一牧區(qū)不同牧民家庭的原料乳中分離得到的酵母菌的種類和數(shù)量存在一定差異性，如2號(hào)樣品和3號(hào)樣品，這可能是因?yàn)樵先榇嬖诘沫h(huán)境不同，因?yàn)槿樵唇湍复蠖鄶?shù)來(lái)自原料乳環(huán)境及加工設(shè)備與周圍環(huán)境[14]。但采集自不同牧區(qū)的原料乳樣品中，所含的優(yōu)勢(shì)菌群是相同的，均為庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），而根據(jù)他人研究，原料乳中的酵母菌主要是Candida catenulata、Candida pararugosa、Candida rugosa[15]等。 王冠群[16]等人對(duì)塔城部分地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，Issatchenkia orientalis為第二優(yōu)勢(shì)菌群，而根據(jù)Kurtzman等人[17]研究，已將Issatchenkia屬歸入Pichia屬，由于P.orientalis已經(jīng)存在，Iss.orientalis在歸入Pichia屬中后要一個(gè)新的種名，所以使用P.kudriavzevii來(lái)代替它，由此本研究與前人研究結(jié)果相符。但從目前許多對(duì)乳制品中酵母菌的研究來(lái)看，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)乳制品中庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）的詳盡報(bào)道。并且本研究分離得到的酵母菌的種類和數(shù)量關(guān)系與其他研究存在較大差異，可能是由于不同地區(qū)環(huán)境、氣候條件、溫度、濕度等存在差異，因而引起原料乳中的酵母菌含量和種類的不同。