吳燕燕 章辰飛 吳志勇 吳月燕

摘要：以金艷獼猴桃嫩葉、莖段作為外植體材料，研究不同消毒體系滅菌效果及不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根等誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，葉片消毒相對最優(yōu)方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，莖段消毒相對最優(yōu)方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min;莖段比葉片更容易染菌，而葉片比莖段更容易褐化;愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，葉片最優(yōu)激素組合為6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，莖段為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L;不定芽誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此條件下不定芽長勢較快，含單芽或多芽，有少量愈傷組織;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.8 mg/L，生根率達(dá)到87.78%，植株生長健壯，根密、多。

關(guān)鍵詞：金艷;獼猴桃;組織培養(yǎng);激素;愈傷組織;嫩葉;莖段

中圖分類號： S663.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0111-04

收稿日期：2018-08-22

基金項(xiàng)目：浙江省一流學(xué)科（A）生物工程創(chuàng)新（編號：CX2017013）。

作者簡介：吳燕燕（1993—），女，浙江杭州人，碩士，從事植物生理生化研究。E-mail：935986197@qq.com。

通信作者：吳月燕，碩士，從事遺傳育種研究。E-mail：wyynb2009@163.com。

在獼猴桃快繁技術(shù)體系建立中，通常是以葉片、葉柄、莖尖、莖段、種子等作為外植體進(jìn)行研究的[1-6]，而不同外植體材料對愈傷組織、不定芽的誘導(dǎo)能力有很大差別，如甘麗萍等研究指出，嫩莖是誘導(dǎo)愈傷組織最好的外植體[7]。對同一種外植體而言，不同放置方式也會(huì)影響快繁效果，有研究表明，葉片上表面朝下的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，莖段橫放比豎放誘導(dǎo)效果好[8]。同時(shí)，在組織培養(yǎng)過程中，不同生長調(diào)節(jié)劑（激素）會(huì)發(fā)揮不同的作用，生長素、細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)中對組織生長起著非常關(guān)鍵的作用。另外，碳源種類、濃度等也會(huì)影響組織培養(yǎng)快繁效果，有研究表明，低濃度碳源不能很好誘導(dǎo)芽的分化形成，而過高濃度碳源雖可促進(jìn)芽分化，但抑制苗的生長[9]。

金艷是中國科學(xué)院武漢植物園以“毛花”獼猴桃為母本，“中華”獼猴桃為父本雜交培育出的獼猴桃新品種[10]，具有豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、可溶性固形物含量高、果實(shí)極耐貯藏、糖酸比高等優(yōu)良特性[10-11]，目前鮮見對金艷獼猴桃組織培養(yǎng)快繁的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以金艷獼猴桃莖段、葉片為外植體，設(shè)計(jì)不同激素濃度及配比，以篩選出適宜金艷獼猴桃組織培養(yǎng)快繁的條件，為金艷獼猴桃的快速推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料選擇

2017年4—5月，于浙江省寧波市北侖區(qū)北侖芳野瓜果有限公司獼猴桃基地采取金艷獼猴桃?guī)в心廴~的新梢莖段，冰箱中4 ℃冷藏。

1.2不同消毒劑及消毒時(shí)間對金艷獼猴桃外植體的滅菌效果

將采集的金艷獼猴桃?guī)~莖段，去爛葉爛頭，用洗潔精清洗1次，再用流水沖洗30 min;分別取3～6 cm的莖段、5～30 cm2 的嫩葉，分別以70%乙醇、0.1%氯化汞（HgCl2）處理不同時(shí)間進(jìn)行滅菌消毒;無菌水清洗4～5次，濾干，用無菌紙吸干莖段或嫩葉表面水分;切取莖段長約1 cm、葉片約0.5 cm2，并接種到培養(yǎng)基上，定期觀察外植體污染、褐化數(shù)量及生長情況，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率，計(jì)算消毒效果[7]。

1.3不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根的誘導(dǎo)情況

1.3.1愈傷組織誘導(dǎo)無菌環(huán)境條件下，將經(jīng)預(yù)處理的葉片及莖段分別接種到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加有6-芐氨基嘌呤（6-BA）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（NAA）0.1、0.5 mg/L為組合激素的培養(yǎng)基上，共設(shè)置10個(gè)處理;接種后20 d調(diào)查各處理愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.3.2不定芽誘導(dǎo)無菌環(huán)境條件下，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加有6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L和NAA 0.1、0.3、0.5 mg/L為組合激素的培養(yǎng)基上，共設(shè)置9個(gè)處理;接種后20 d調(diào)查各處理愈傷組織不定芽誘導(dǎo)情況。

1.3.3生根誘導(dǎo)無菌環(huán)境條件下，將誘導(dǎo)形成帶有4～5張葉片的不定芽轉(zhuǎn)接到以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加吲哚丁酸（IBA）0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后30 d調(diào)查統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.4培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中須同時(shí)添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH值調(diào)控到在5.7～5.8之間。培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)溫度為23～26 ℃，光照度為1 000～1 500 lx，光照時(shí)間為16 h/d。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑及消毒時(shí)間對金艷獼猴桃外植體的滅菌效果

消毒不僅是將外植體表面的微生物去除，同時(shí)也是對外植體自生菌的消減，會(huì)對外植體本身造成一定影響，而消毒劑種類和消毒時(shí)間的不同會(huì)影響其對外植體的消毒效果。由表1可知，葉片消毒效果相對最好的方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，此時(shí)污染率為12.50%，褐化率為12.50%，消毒效果達(dá)到87.50%，莖段消毒效果相對最好的方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min，此時(shí)污染率為7.50%，褐化率為10.00%，消毒效果達(dá)到91.25%;同種消毒劑消毒不同時(shí)間，對金艷獼猴桃外植體的效果差異較大，消毒劑為70%乙醇時(shí)，不同消毒時(shí)間葉片污染率高低為10 s>20 s>30 s，莖段為10 s>20 s=30 s，消毒劑為0.1% HgCl2時(shí)，不同消毒時(shí)間葉片污染率高低依次為3 min>4 min>5 min，莖段為3 min>4 min=5 min，說明消毒時(shí)間越長，外植體滅菌效果相對越好;同一消毒劑消毒相同時(shí)間，莖段污染率多高于葉片，說明莖段比葉片更容易染菌，這可能是由于莖段采集時(shí)會(huì)產(chǎn)生傷口，進(jìn)而導(dǎo)致莖段更易遭受外生菌和內(nèi)生菌侵染;消毒劑為70%乙醇時(shí)，不同消毒時(shí)間葉片褐化率高低依次為20 s=30 s>10 s，莖段為30 s>20 s>10 s，消毒劑為0.1% HgCl2時(shí)，不同消毒時(shí)間葉片、莖段褐化率高低均依次為5 min>4 min>3 min，說明消毒時(shí)間越長，消毒劑對葉片、莖段傷害越大，并主要表現(xiàn)在外植體的切面上;同一消毒劑消毒相同時(shí)間，葉片的褐化率多高于莖段，其褐化程度相對更為嚴(yán)重，這一方面可能是由于切取葉片時(shí)受到的機(jī)械傷害大于莖段，另一方面可能是消毒劑對葉片的毒害作用高于莖段。

2.2不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根誘導(dǎo)的影響

2.2.1對愈傷組織誘導(dǎo)的影響葉片、莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織分別見圖1、圖2，影響結(jié)果見表2。由表2可知，誘導(dǎo)產(chǎn)生葉片愈傷組織的相對最適激素組合為6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其誘導(dǎo)率為90.0%，而激素組合6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L 的誘導(dǎo)率相對最低，僅為48.5%;誘導(dǎo)產(chǎn)生莖段愈傷組織的相對最適激素組合為6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，其誘導(dǎo)率為97.5%，而激素組合6-BA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的誘導(dǎo)率相對最低，僅為43.0%;NAA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，葉

片愈傷組織誘導(dǎo)率總體呈先增后降趨勢，說明適度低質(zhì)量濃度6-BA有利于葉片愈傷組織的產(chǎn)生，而高質(zhì)量濃度6-BA不利于葉片愈傷組織的產(chǎn)生;對莖段而言，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率呈逐漸下降趨勢，而在NAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時(shí)，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率呈先下降后上升趨勢，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。

2.2.2對不定芽誘導(dǎo)的影響由表3可知，激素組合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L時(shí)，不定芽分化率相對最高，達(dá)到65.00%，不定芽長勢較快，含有單芽或多芽，有少量愈傷組織產(chǎn)生; 當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加?愈傷組織不定芽分化率呈先增后降趨勢?當(dāng)NAA質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5 mg/L時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織不定芽分化率呈增加趨勢，說明高質(zhì)量濃度6-BA有利于不定芽的分化，而NAA為0.1 mg/L時(shí)出現(xiàn)的下降可能是由于6-BA與NAA用量比值過高，抑制了不定芽的產(chǎn)生;6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度的增加，不定芽分化率呈逐漸下降趨勢，高質(zhì)量濃度NAA抑制愈傷組織分化成不定芽，還對不定芽的生長產(chǎn)生抑制作用。

2.2.3對生根培養(yǎng)的影響圖3為不定芽誘導(dǎo)形成的苗，圖4為生根的無菌苗，對生根培養(yǎng)的影響結(jié)果見表4，由表4可知?隨IBA濃度的增加?不定芽生根率呈先升后降趨勢，IBA質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時(shí)生根率相對最高，達(dá)到87.78%，此時(shí)植株生長健壯，根密、多;IBA質(zhì)量濃度分別為0.5、0.9 mg/L 時(shí)，不定芽生根率都低于25.0%，說明IBA質(zhì)量濃度過低或過高都不利于根的生長。

3結(jié)論與討論

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)中至關(guān)重要且必不可少的環(huán)節(jié)，而消毒劑的選擇與使用十分關(guān)鍵。消毒劑種類很多，找到適宜的消毒劑和消毒時(shí)間對組織培養(yǎng)可起到事半功倍的作用。于紅梅等研究認(rèn)為，0.1% HgCl2作為消毒劑，其消毒效果明顯好于NaClO、H2O2[7]。 本試驗(yàn)結(jié)果表明??葉片最適消毒組合為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，消毒效果達(dá)到87.50%;莖段消毒最適組合為70%乙醇30 s+0.1% HgCl24 min，消毒效果達(dá)到91.25%;莖段比葉片更容易染菌，這可能是由于莖段采集時(shí)會(huì)產(chǎn)生傷口，進(jìn)而導(dǎo)致莖段更易遭受外生菌和內(nèi)生菌侵染;葉片比莖段更容易褐化，這可能是由于切取葉片時(shí)受到的機(jī)械傷害大于莖段?或是消毒劑對葉片的毒害作用高于莖段。

生長素是植物愈傷組織誘導(dǎo)中必須使用的物質(zhì)[12-13]。杜希華等研究指出，培養(yǎng)基中只添加6-BA是無法誘導(dǎo)出愈傷組織的，生長素和細(xì)胞分裂素的配合使用有利于愈傷組織的誘導(dǎo)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，低質(zhì)量濃度6-BA有利于葉片愈傷組織的產(chǎn)生，而高質(zhì)量濃度6-BA 不利于葉片愈傷組織的產(chǎn)生;NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率呈逐漸下降趨勢，而在NAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率呈先下降后上升趨勢，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，這與吳興海的研究結(jié)果[15]較為吻合。

細(xì)胞分裂素對獼猴桃愈傷組織分化和芽分化誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用[16]。朱寶成等認(rèn)為，NAA除能誘導(dǎo)愈傷組織分化外，還能跟6-BA配合使愈傷組織分化出芽和根[17]。楊成行等研究表明，金線蓮再生培養(yǎng)體系中，細(xì)胞分裂素和生長素配合使用能促進(jìn)叢生芽的誘導(dǎo)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度的增加，不定芽分化率呈逐漸下降趨勢，高質(zhì)量濃度NAA抑制愈傷組織分化成不定芽，還對不定芽的生長產(chǎn)生抑制作用，這可能是由于NAA作為生長素誘導(dǎo)形成愈傷組織的效果要明顯優(yōu)于不定芽，同時(shí)也符合生長素與細(xì)胞分裂素比值越小則越有利于芽分化，而比值越大則有利于根分化的試驗(yàn)規(guī)律;NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織不定芽分化率呈先增后降趨勢，這種下降的出現(xiàn)可能與6-BA、NAA比值過高而存在毒副作用，從而抑制不定芽的產(chǎn)生[15]有關(guān)。

吳興海研究指出，使用IBA 0.6 mg/L誘導(dǎo)獼猴桃生根時(shí)會(huì)產(chǎn)生少量愈傷組織，生根率低，且芽的生長受到抑制[15]。隆前進(jìn)認(rèn)為，高質(zhì)量濃度IBA處理獼猴桃扦插苗可能會(huì)有毒害作用而降低其生根率[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，金艷獼猴桃最適生根的IBA質(zhì)量濃度為0.8 mg/L，其生根誘導(dǎo)率相對最高，達(dá)87.78%，而不論是低質(zhì)量濃度IBA還是更高質(zhì)量濃度IBA都不利于根的生長;IBA質(zhì)量濃度為0.9 mg/L時(shí)獼猴桃生根率出現(xiàn)驟降，可能與高質(zhì)量濃度IBA對不定芽產(chǎn)生毒害作用有關(guān)。

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