朱 振， 曹旭鵬， 苑廣澤， 劉 嬌， 薛 松， 田 晶??

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連116034；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116032； 3.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353)

微藻種類繁多且代謝系統(tǒng)豐富多樣，特別是真核藻類，具有巨大的基因調(diào)控潛力，被認(rèn)為是最具潛力的下一代生物質(zhì)提供者[1-2]。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是目前研究最充分的微藻：可直接獲得的野生或人工株系超過3 000株(chlamycollection.org中心保藏)，其核基因組編碼基因超過15 000個；在phytozome(phytozome.jgi.doe.gov)的V5.5版本數(shù)據(jù)庫中收錄超過130個典型培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；葉綠體和線粒體基因組也已完成測序。作為光合真核微藻，其表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后修飾能力和細(xì)胞器表達(dá)能力(葉綠體和線粒體)，兼具植物和微生物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢。上述萊茵衣藻的特點為其在基因工程、代謝工程和合成生物學(xué)方面的應(yīng)用提供了豐富的選擇性[3]。

常見的真核微藻表達(dá)系統(tǒng)分為2類。一種是利用細(xì)胞器作為表達(dá)系統(tǒng)，如將外源基因重組到葉綠體DNA中進(jìn)行表達(dá)[4-5]，其優(yōu)點是外源蛋白可以在葉綠體內(nèi)高含量存在，其缺點是葉綠體基因組中可操作的位點及可插入片段長度、數(shù)量有限。另一種是利用核表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因重組到核基因組，在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白。相比而言，對真核微藻核基因組的操作選擇性更為多樣，且胞質(zhì)內(nèi)蛋白表達(dá)的方式更豐富，可以根據(jù)不同目的選擇不同的策略。

在光合微藻和高等植物中，1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)是參與光合作用和光呼吸過程的關(guān)鍵酶，也是胞內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。該蛋白有4個大亞基(RbcL)和4個小亞基(RbcS)組成，其中RbcL是葉綠體編碼蛋白，RbcS是核編碼蛋白[6]。已有研究表明，萊茵衣藻基因組中有2個RbcS編碼基因，相似度極高，其中RbcS2(Cre02.g120150.t1.1)具有表達(dá)量高且相對穩(wěn)定的特點[7]，因此已被廣泛用于微藻重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建[1]。

內(nèi)外源基因的表達(dá)按其目標(biāo)來說可以分為2類：一類是以蛋白本身作為產(chǎn)物，如利用代謝工程、合成生物學(xué)等手段構(gòu)建細(xì)胞工廠，用來高效獲得正確折疊的蛋白；另一類是以研究基因/蛋白的功能為目標(biāo)的，作為工具研究生物學(xué)機(jī)制。相比之下，微藻內(nèi)外源基因表達(dá)的第二類應(yīng)用具有更廣闊的需求。影響內(nèi)外源基因在微藻細(xì)胞中表達(dá)效率的因素有很多，其中，啟動子在基因表達(dá)系統(tǒng)中就是關(guān)鍵元件[2]，有研究表明，熱休克蛋白Hsp70A啟動子能提升外源基因的表達(dá)，并能緩解衣藻中轉(zhuǎn)入基因的沉默[8]。Schroda等利用熱休克蛋白Hsp70A啟動子的特點，在2002年提出構(gòu)建Hsp70A-RbcS2嵌合啟動子，隨后，在Hsp70A-RbcS2上引入更多的調(diào)控組件[9]，包括RbcS2的第一個內(nèi)含子和3’-UTR等，使Hsp70A-RbcS2逐漸成為萊茵衣藻蛋白表達(dá)效果最好且應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)[1]。Invitrogen公司基于上述研究推出了GeneArt?ChlamydomonasEngineering Kits表達(dá)系統(tǒng)，主要是在RbcS2啟動子引發(fā)的表達(dá)系統(tǒng)中加入了不同的調(diào)控元件，其中pChlamy_1表達(dá)系統(tǒng)中引入了RbcS2的第一內(nèi)含子序列，提升了外源蛋白的表達(dá)量；pChlamy_3表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步在pChlamy_1終止密碼子后引入了RbcS2基因的3’-UTR序列，進(jìn)而實現(xiàn)了相對穩(wěn)定的蛋白表達(dá)量。

作為一種典型的研究體系，萊茵衣藻氮脅迫條件下儲能物質(zhì)的積累規(guī)律一直為大家所關(guān)注。本實驗室前期工作中，借助修飾蛋白質(zhì)組技術(shù)識別出萊茵衣藻在受到氮脅迫時，葉綠體型磷酸甘油醛脫氫酶(Glycera-ldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)發(fā)生了顯著的泛素化[10]。通常GAPDH作為糖酵解的關(guān)鍵酶參與糖的利用，并且葉綠體型GAPDH，在卡爾文循環(huán)中也是光合固碳的重要環(huán)節(jié)。那么葉綠體型GAPDH對儲能物質(zhì)的積累起到何種作用？為了探索其生理功能，本研究以經(jīng)典的野生型萊茵衣藻藻株cc-137c為宿主，分別以上述2種不同表達(dá)水平的表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建相應(yīng)的轉(zhuǎn)化株，考察其生長和儲能物質(zhì)積累過程的變化，進(jìn)而對葉綠體型GAPDH的功能加以推測。

1 材料與方法

1.1 藻株及質(zhì)粒介紹

萊茵衣藻cc-137c購買自Chlamycollection中心，編號cc-124 wild type mt-[137c]。pChlamy_1直接來源于Invitrogen公司，pChlamy_3載體在pChalmy_1的基礎(chǔ)上利用RF克隆技術(shù)[11]插入3’-UTR序列并測序驗證。研究使用的GAPDH(NCBI：XM_001689819.1)委托金為智公司合成獲得，GAPDH基因片段為1 144 bp。萊茵衣藻使用標(biāo)準(zhǔn)TAP培養(yǎng)基[12]，24 h連續(xù)光照，光強(qiáng)為50 μmol·m-2·s-1，搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 r/min。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建 本文使用2種表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH，其圖譜如圖1所示。利用人工合成得到pChlamy_1-GAPDH，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)得到萊茵衣藻cc-137c藻細(xì)胞中的3’-UTR(234 bp)片段，利用RF克隆方法，其中RF的第二步(RF2)反應(yīng)體系如表1所示，獲得pChlamy_3-GAPDH。上述PCR反應(yīng)中所用的Cr3U-F/R引物序列如表2所示，且均是在TakaraPrimeSatrmaxPremixkit的50μL體系中進(jìn)行。

圖1 pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH重組質(zhì)粒圖Fig.1 The map of pChlamy_1-GAPDH and pChlamy_3-GAPDH

表1 重組質(zhì)粒pChlamy_3-GAPDH的RF2反應(yīng)體系Table 1 Recombinant plasmidspChlamy_3-GAPDH of RF2 clone reaction system

萊茵衣藻RbcS2的3’-UTR序列擴(kuò)增過程如下：將0.5 mL生長至指數(shù)生長期末期的cc-137c細(xì)胞(OD750吸光度值約1.0)離心收集，用20 μL無菌水重懸，100 °C加熱裂解5 min。冷卻后，取1 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將純化后的RF克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，然后涂布于含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)皿上，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后由寶生物公司進(jìn)行測序驗證。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化藻株篩選 各取3 μg待轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶PvuI進(jìn)行線性化，用于電擊轉(zhuǎn)化。具體步驟如下：將萊茵衣藻cc-137c接種至TAP培養(yǎng)基中，接種OD750約0.05，培養(yǎng)至OD750至0.3～0.5之間，取15 mL藻細(xì)胞，離心取上清，用250 μL 40 mmol/L的蔗糖TAP溶液重懸藻細(xì)胞，加入電擊杯中，再加入2～3 μg的線性化質(zhì)粒，輕輕振蕩混勻(空白對照不加質(zhì)粒，只加對應(yīng)體積的無菌水)，使用Bio-Rad?Gene Pulser?II進(jìn)行電轉(zhuǎn)，參數(shù)為：600 V，50 μF，電阻無窮大。電擊結(jié)束后，按照每125 μL接種至5 mL 40 mmol/L蔗糖TAP溶液的比例，在六孔板中光照培養(yǎng)24 h。隨后，取1～2 mL藻液在2 500 r/min下離心10 min，用150 μL的40 mmol/L蔗糖TAP溶液重懸藻細(xì)胞，涂布在10 μg·mL-1潮霉素平板進(jìn)行初篩。隨后，對2種轉(zhuǎn)化株的單克隆分別進(jìn)行單藻落PCR驗證。第一輪引物為載體上的通用引物PC-F/R；第二輪為陽性克隆使用對應(yīng)的特異性引物GAPDH-F/R，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增驗證。引物序列如表2所示。

1.2.3 轉(zhuǎn)化藻株培養(yǎng)

1.2.3.1 轉(zhuǎn)化藻株在TAP平板培養(yǎng) 挑選每種轉(zhuǎn)化藻株中的陽性克隆，在含有抗生素的TAP瓊脂培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)為50 μmol photons·m-2·s-1，在光照14 h∶黑暗10 h光照條件下，倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察藻細(xì)胞在TAP固體培養(yǎng)基上的生長情況。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)化藻株在TAP溶液培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化藻株在含有10 μg·mL-1潮霉素的液體TAP培養(yǎng)基中進(jìn)行5代傳代培養(yǎng)后，用于進(jìn)一步評價。為了保證評價過程中藻細(xì)胞不受到抗生素的影響，選擇在正常的TAP培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，在24 h光強(qiáng)為50 μmol photons·m-2·s-1的光照條件下，將起始密度OD750在0.07～0.09的100 mL微藻培養(yǎng)于250 mL搖瓶中，設(shè)置3個平行。在100 r/min搖床上連續(xù)培養(yǎng)5 d，每天定時取樣測定OD750、葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、干重。取樣遵循不放回原則，同時培養(yǎng)野生型萊茵衣藻cc-137c作為對照。剩余藻細(xì)胞冷凍離心，放入液氮中速凍，在-80 °C冰箱保存。

1.2.4 細(xì)胞生長的測定 微藻細(xì)胞密度：采用Jasco V-530紫外分光光度計測定，測定波長為750 nm，當(dāng)藻液吸光度值大于1時，進(jìn)行稀釋重新測定。

細(xì)胞干重測定：取5～20 mL 藻液，4 000 r/min離心10 min后，棄上清液，用0.5 mol·L-1碳酸氫銨溶液洗滌，過濾到預(yù)先烘干并稱重的玻璃纖維濾膜上，烘干(60 ℃，24 h)后稱重[13]，計算干重(mg·mL-1)。

1.2.5 葉綠素?zé)晒獾臏y定 采用Water-PAM(Walz，德國)葉綠素?zé)晒鈨x測定光合系統(tǒng)II(Photosystem II，PS II)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm。具體過程為：微藻細(xì)胞經(jīng)過暗適應(yīng)10 min后，先用檢測光(ML，15 μmol·m-2·s-1)照射，測定初始熒光值為Fo；再用強(qiáng)飽和脈沖光(SP, 0.6 s, 330 μmol·m-2·s-1)激發(fā)，測定最大熒光值為Fm；最后計算出PS II的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量[14]，即Fv/Fm值，F(xiàn)v/Fm= (Fm-Fo)/Fm。

1.2.6 Westernblot驗證 在每種藻細(xì)胞中加入1 mL裂解液和蛋白酶抑制劑[10]，放在組織細(xì)胞破碎儀(SCIENTZ-48)進(jìn)行破碎，完成后在冰上放置1～2 h，以便藻細(xì)胞被充分裂解，冷凍離心取上清液，得到蛋白樣品，并利用考馬斯亮藍(lán)法測定每個樣品的蛋白濃度。將蛋白和loadingbuffer(Coomassie Brilliant Blue G-250)混勻加熱變性，在10%的SDS-PAGE膠中進(jìn)行恒壓90 V電泳，完成后，切去SDS-PAGE膠的濃縮膠部分，將與膠大小相同的PVDF膜放入甲醇溶液中活化10 min，組裝好PVDF膜和膠，在電轉(zhuǎn)儀(Bio-rad)中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，設(shè)定250 mA恒流電轉(zhuǎn)1 h，完成后，將PVDF膜在5%牛奶中封閉1 h，用TBST溶液洗膜后，放入一抗溶液中孵育過夜，同種樣品分別孵育在His-Taq(ABclonal.NO:AE003)和GAPDH(CST 5174,XP? Rabbit)一抗中，抗體均以1∶1 000比例稀釋，一抗孵育結(jié)束后，洗膜，放入二抗稀釋液中孵育2 h，完成后洗膜，采用Tanon TMHigh-sig ECL Western Blotting Substrate顯色液顯色，在Multifunctional imager:FUSION-FX5-820進(jìn)行曝光[15]。

1.2.7 總糖測定 稱量2～3 mg的干燥藻粉置于5 mL EP管中，加入2 mL去離子水，超聲破碎細(xì)胞，將藻細(xì)胞破碎液定容至5 mL。配制葡萄糖濃度為0，0.02、0.04、0.06、0.08和0.10溶液各1 mL，各藻液樣品也稀釋為1 mL，每個樣品加入5 mL蒽銅試劑，振蕩混勻后沸水浴10 min。水浴結(jié)束后，以去離子水為空白調(diào)零，于621 nm處測定吸光度[16]。制作“葡萄糖濃度-吸光度”標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程。計算藻細(xì)胞中總糖含量，總糖含量(%)=稀釋后的葡萄糖濃度(mg·mL-1)×稀釋倍數(shù)×定容體積/藻粉質(zhì)量(mg)×100%。

1.2.8 脂肪酸測定 按照文獻(xiàn)[17-18]介紹的方法測定藻細(xì)胞中脂肪酸組分和含量，稱取5 mg左右藻粉于10 mL 圓底燒瓶，加入內(nèi)標(biāo)碳十七烷酸甘油三酯(SigmaAldrich)，并加入5 mL的2%硫酸-甲醇溶液(v/v)，70°C水浴1 h，轉(zhuǎn)酯化的反應(yīng)結(jié)束后，待樣品冷卻，加入0.75 mL去離子水和2 mL正己烷，磁力攪拌器上攪拌1 min，靜置分層，取上層己烷層加入到含有適量無水硫酸鈉的離心管中除水，轉(zhuǎn)移到樣品瓶中采用帶有FID檢測器的Agilent GC 7890A進(jìn)行測定。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建PCR結(jié)果

所構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過測序，堿基序列與設(shè)計一致。

2.2 轉(zhuǎn)化藻株的初步篩選與PCR驗證

在抗性平板中，涂布第二天即出現(xiàn)肉眼可見轉(zhuǎn)化株，如圖2E、F所示，該轉(zhuǎn)化株出現(xiàn)時間要早于試劑盒以及本實驗室其它轉(zhuǎn)化實驗中約3～5 d。在抗生素初篩基礎(chǔ)上挑選出優(yōu)先生長出來的單克隆，進(jìn)行PCR的驗證，如圖2所示：A和B是代表pChlamy_1-GAPDH轉(zhuǎn)化株，C和D是代表pChlamy_3-GAPDH轉(zhuǎn)化株。

(圖A～D為轉(zhuǎn)化株的PCR驗證結(jié)果，其中A、C使用的是載體通用引物對，B、D使用的是外源GAPDH特異性引物對，箭頭所示為目標(biāo)條帶。圖E和F為挑選出pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH轉(zhuǎn)化株在抗性平板生長情況照片。A～D. Results of PCR verification by general primers and gene specific primers. A、C: By general primers; B、D: By gene specific primers. E and F. Transformants of pChlamy_1-GAPDH and pChlamy_3-GAPDH on agar plates.)

圖2 轉(zhuǎn)化藻株的PCR驗證和轉(zhuǎn)化藻株的平板培養(yǎng)
Fig.2 The PCR verification of transformed algae andthe cultivation of transformed algae

對比每種轉(zhuǎn)化株陽性克隆的個數(shù)，如表3所示，其中pChlamy_1-GAPDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率達(dá)22%，pChlamy_3-GAPDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率達(dá)27%，這兩個體系的轉(zhuǎn)化率符合GeneArt?ChlamydomonasEngineering Kits說明書中介紹通常約有20%的陽性克隆。

表3 轉(zhuǎn)化藻株的PCR篩選Table 3 The PCR screen of transformed algae

Note:①Transformant；②PCR monoclonal;③Positive clone；④Transformation rate

2.3 轉(zhuǎn)化株液體培養(yǎng)結(jié)果分析

野生型cc-137c(WT)，pChlamy_1-GAPDH，pChlamy_3-GAPDH 3種藻株連續(xù)培養(yǎng)5 d，其葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)Fv/Fm變化如圖3所示。3種藻株的Fv/Fm在相同的水平，不存在顯著差異。

圖3 轉(zhuǎn)化株和WT的葉綠素?zé)晒庾兓疐ig.3 Changes in chlorophyll fluorescence of transformed algae and WT

這3種藻株的OD750盡管略有差異，但變化趨勢基本保持一致，如圖4A所示，均在培養(yǎng)第3天時，細(xì)胞密度達(dá)到最大值，即OD750達(dá)到1.9～2.0，隨后進(jìn)入生長穩(wěn)定期；如圖4B所示，對比各干重變化趨勢，在培養(yǎng)第3天時，轉(zhuǎn)化株pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH的干重均達(dá)到0.6 mg·mL-1以上，而WT的干重在0.53 mg·mL-1左右。

2.4 轉(zhuǎn)化株中GAPDH蛋白Western blot驗證

經(jīng)過優(yōu)化，分別使用40 μg pChlamy_1-GAPDH總蛋白和150 μg pChlamy_3-GAPDH總蛋白進(jìn)行Western blot驗證。結(jié)果表明，pChlamy_1-GAPDH的表達(dá)量變化較大，如圖5A中a-1和a-2所示，在第一天時含量較低，但是隨著細(xì)胞生長至穩(wěn)定期而明顯增多；相比而言，整體上pChlamy_3-GAPDH的表達(dá)量處于比較穩(wěn)定水平，相對豐度如圖5A中b所示，未有pChlamy_1-GAPDH的表達(dá)量高。這也與Invitrogen公司對這兩種表達(dá)系統(tǒng)的介紹相一致，pChlamy_3相對于pChlamy_1能夠提供更穩(wěn)定的外源蛋白表達(dá)。

(A： 轉(zhuǎn)化株和WT的生長曲線變化； B： 轉(zhuǎn)化株和WT的干重變化。A: Changes in the growth curve of transformed algae and WT； B: Changes in the dry weight of transformed algae and WT.)

圖4 轉(zhuǎn)化株和WT的生長曲線和干重變化
Fig.4 Changes in the growth curve and dry weight of transformed algae and WT

2.5 總糖含量測定

WT、pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH 3種藻株的總糖含量如圖5A所示，表現(xiàn)出了明顯的規(guī)律性。其中WT相對轉(zhuǎn)化株總糖含量最少，約占干重的9%～13%；pChlamy_1-GAPDH和WT在起始階段總糖含量在同一水平，但伴隨著GAPDH表達(dá)量的提升，而進(jìn)入一個較高水平，在第二天達(dá)到干重的17%，隨后有所下降；而pChlamy_3-GAPDH的總糖含量變化趨勢與WT相接近，但是一致保持高于WT，從接種時的17%下降至指數(shù)生長期的11%，隨著進(jìn)入穩(wěn)定期而逐漸回升。

2.6 脂肪酸含量測定與分析

轉(zhuǎn)化株與WT的脂肪酸含量變化如圖5B所示。因為是富營養(yǎng)培養(yǎng)，所以WT中脂肪酸含量保持穩(wěn)定，在10%～11%左右；pChlamy_1-GAPDH轉(zhuǎn)化株的脂肪酸含量呈現(xiàn)出與生長曲線類似的變化趨勢，由初始時與WT相同水平的10%含量，在第4天脂肪酸含量開始迅速上升至13%，并維持，而這也與該階段外源GAPDH表達(dá)量的變化相一致；相比之下，pChlamy_3-GAPDH轉(zhuǎn)化株的脂肪酸含量一直維持穩(wěn)定且高水平，脂肪酸含量在15%左右。

進(jìn)一步分析脂肪酸構(gòu)成的變化，如圖6和7所示。對比轉(zhuǎn)化株主要發(fā)生變化的脂肪酸組分，發(fā)現(xiàn)pChlamy_3-GAPDH脂肪酸含量增加最明顯的主要包括C16:0、C16:4n3、C18:3n3這3種脂肪酸，其中C16:0是脂肪酸代謝的起始階段的脂肪酸代表，而C16:4n3，C18:3n3是被認(rèn)為在葉綠體中所特有的脂肪酸[18]；pChlamy_1-GAPDH的脂肪酸主要是在C16:0，C16:4n3和C18:2n6，脂肪酸含量的上升與GAPDH蛋白表達(dá)量相關(guān)，其中C16:0和C16:4n3是隨著轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)而增高的。

(A：轉(zhuǎn)化株和WT總糖含量變化和轉(zhuǎn)化株GAPDH western blot；a-1：pChlamy_1-GAPDH培養(yǎng)第一天樣品western blot結(jié)果，a-2：pChlamy_1-GAPDH培養(yǎng)第三天樣品western blot結(jié)果； b：pChlamy_3-GAPDH培養(yǎng)第四天樣品western blot結(jié)果；G：代表目的蛋白GAPDH條帶，C：代表內(nèi)參蛋白條帶。B：轉(zhuǎn)化株和WT總脂肪酸含量變化。A: Changes of carbohydrate content of transformed algae and WT and western blot of GAPDH; a-1: Western blot results of the pChlamy_1-GAPDH in the first day, a-2: Western blot results of the pChlamy_1-GAPDH in the third day; b: Western blot results of the pChlamy_3-GAPDH in the fourth day; G: The target protein GAPDH, C: The internal control protein. B: Changes of lipid content of transformed algae and WT.)

圖5 轉(zhuǎn)化株和WT總糖和總脂肪酸含量變化以及轉(zhuǎn)化株GAPDH westernblot驗證

Fig.5 The total carbohydrate and lipid content and westernblotof GAPDH

圖6 轉(zhuǎn)化株和WT的脂肪酸各組分的含量Fig.6 The content of each composition of fatty acids in dry weight of transformants and WT

圖7 轉(zhuǎn)化株和WT的脂肪酸組成Fig.7 Fatty acid composition of transformed algae and WT

結(jié)合2.5中的結(jié)果，說明GAPDH的轉(zhuǎn)入，能夠顯著促進(jìn)萊茵衣藻固碳后儲能物質(zhì)的積累。如表4所示，pChlamy_3-GAPDH中的最大脂肪酸日積累量為44.8 mg·L-1，相對于WT提高了55.2%；而pChlamy_1-GAPDH中最大脂肪酸日積累量為33.5 mg·L-1，相對于WT提高了15.9%。同時，以總糖和總脂肪酸含量之和作為總儲能物質(zhì)生產(chǎn)的指標(biāo)，進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的最大日儲能物質(zhì)量分別為84.2和91.8 mg·L-1，通過比較各種藻株的最大儲能物質(zhì)產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)2種轉(zhuǎn)化藻株的總體固碳能力均有明顯提高，相對于WT分別提高了60.7%和75.2%。

表4 GAPDH轉(zhuǎn)化對cc-137儲能物質(zhì)生產(chǎn)能力的影響Table 4 Effectsof exogenous GAPDH on the energy storage compounds productivity

注：a：脂肪酸最大產(chǎn)率的提高，b：最大固碳速率的提高；**表示數(shù)據(jù)具有極顯著性差異。

Note：The maximum yield of lipid increased, b: the maximum carbon sequestration rate increases. Dates are shown as** denote extremely significant difference (p<0.01).

3 討論

微藻作為最有潛力的第三代生物質(zhì)能源提供者，如何實現(xiàn)其高效光合固碳生產(chǎn)能源制品，一直是微藻技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域的重點方向[19-20]。同時，作為一種重要水產(chǎn)餌料，微藻的高效定向培養(yǎng)也一直是拓寬餌料應(yīng)用的重要一環(huán)[21-22]。這二者的發(fā)展均離不開微藻光合培養(yǎng)效率的提升。本文也正是基于此目的，希望從關(guān)鍵固碳蛋白的角度對這一領(lǐng)域的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

光合固碳離不開卡爾文循環(huán)，人們在試圖提升微藻和植物的固碳效率過程中，常常將關(guān)注點集中在CO2直接固定的Rubisco復(fù)合體上，因為這是由無機(jī)碳變?yōu)橛袡C(jī)碳的第一步。在植物與微藻中，Rubisco不僅僅是固碳的關(guān)鍵酶，也是重要的氮庫，在氮缺乏條件下，Rubisco將優(yōu)先發(fā)生降解釋放氮元素用于其它必需生理過程。因此，其含量具有很高的冗余度。相比而言，卡爾文循環(huán)中其他酶的研究則相對較少。GAPDH是卡爾文循環(huán)中光合產(chǎn)物葡萄糖分解過程中的重要酶[23]。一般來說，GAPDH在生物體內(nèi)表達(dá)水平穩(wěn)定，是研究轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)重要的內(nèi)參，但是我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，葉綠體型GAPDH在氮缺乏條件下會顯著的發(fā)生聚泛素化，這引起了我們對該蛋白的關(guān)注。相比胞質(zhì)內(nèi)的GAPDH，人們對葉綠體型GAPDH的功能知之甚少。因此，本文工作將首先從GAPDH的過表達(dá)入手，進(jìn)行探索以期加深對葉綠體型GAPDH的認(rèn)識。

由于萊茵衣藻內(nèi)外源蛋白的表達(dá)具有一定的不穩(wěn)定性和隨機(jī)性，我們選用了目前商用典型的2個表達(dá)體系：pChlamy_1和pChlamy_3，其中pChlamy_1只具有萊茵衣藻RbcS2部分表達(dá)調(diào)控序列，表達(dá)蛋白的量具有一定的生長相關(guān)性，而pChlamy_3在pChlamy_1的基礎(chǔ)上增加了3’-UTR序列，能夠使外源基因得到穩(wěn)定表達(dá)。因此，分別構(gòu)建了上述2個系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化株，通過比較，發(fā)現(xiàn)2種轉(zhuǎn)化株儲能物質(zhì)的含量均提高，但是對微藻儲能物質(zhì)積累的影響規(guī)律并不相同。具體而言，在持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源GAPDH的pChlamy_3-GAPDH轉(zhuǎn)化株中，儲能物質(zhì)得到了穩(wěn)定且持續(xù)的生產(chǎn)，最終獲得了更高的產(chǎn)率；而pChlamy_1-GAPDH中GAPDH的表達(dá)量與生長關(guān)聯(lián)，因此，當(dāng)GAPDH進(jìn)入高表達(dá)期時，儲能物質(zhì)才迅速提升。從結(jié)果可以看出，過表達(dá)葉綠體型GAPDH可明顯提升轉(zhuǎn)化株的儲能物質(zhì)生產(chǎn)效率。

綜合實驗結(jié)果，過表達(dá)葉綠體型GAPDH不僅能夠強(qiáng)化CO2轉(zhuǎn)化成碳水化合物，并且能夠進(jìn)一步通過強(qiáng)化糖酵解過程使碳水化合物向油脂轉(zhuǎn)化。這為我們通過基因工程手段及合成生物學(xué)技術(shù)開發(fā)高效儲能物質(zhì)生產(chǎn)工程藻株提供了有力的借鑒。同時，在后續(xù)工作中，我們將延續(xù)這一思路，考察卡爾文循環(huán)中其它幾個與碳水化合物代謝相關(guān)酶過表達(dá)的影響，如fructose-bisphosphate aldolase(EC: 4.1.2.13)。

4 結(jié)論

(1)構(gòu)建了含有葉綠體型GAPDH基因，具有不同表達(dá)模式的2種轉(zhuǎn)化株，通過對其生長和生物質(zhì)組分的測定，發(fā)現(xiàn)葉綠體型GAPDH的過表達(dá)將強(qiáng)化光合儲能物質(zhì)生產(chǎn)，其中具有RbcS2的3’-UTR的pChlamy_3-GAPDH表達(dá)系統(tǒng)更為穩(wěn)定。

(2)與WT相比，轉(zhuǎn)化株pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH分別實現(xiàn)了脂肪酸最大產(chǎn)率15.9%和55.2%的提升，總儲能物質(zhì)積累量60.7%和75.2%的提升，說明在萊茵衣藻中提升葉綠體型GAPDH的表達(dá)量能夠顯著的促進(jìn)其儲能物質(zhì)生產(chǎn)效率的提升。