付璐璐， 李思琦， 甄 毓， 米鐵柱

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266071；3. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；4. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100)

厭氧氨氧化現(xiàn)象對于海洋氮元素生物地球化學循環(huán)及海洋生態(tài)學具有重要的意義。研究者們在海洋低氧水體與沉積物、缺氧海灣盆地[2]、極地海冰[13]、深海熱液噴口[14]等多種海洋低氧環(huán)境中，均發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化細菌的存在，對于生源要素——氮的海洋生物地球化學循環(huán)具有意義重大。研究者在越來越多的海區(qū)中發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化細菌存在的蹤跡[3, 13, 15-18]，通過實時熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)對中國邊緣海沉積物中厭氧氨氧化細菌的豐度進行研究，Dang等[19]在膠州灣中檢測到厭氧氨氧化細菌占總微生物量的0.047%～0.21%，F(xiàn)u等[20]在珠江口海域的研究發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化細菌與總微生物量的比值僅為0.02%，結(jié)合本課題組此前在長江口及鄰近海域研究厭氧氨氧化細菌比例在0.26%～5.2%之間的實驗結(jié)果[21]，可以看出，相較于總微生物量，海洋生態(tài)環(huán)境中厭氧氨氧化細菌的豐度較低，通過微生物16S rRNA基因通用引物來研究厭氧氨氧化細菌的群落組成尤為困難。而考慮到不同屬的厭氧氨氧化細菌的16S rRNA基因序列分歧較大(<87.1%序列相似性)[22]，選擇能夠覆蓋全部厭氧氨氧化細菌的16S rRNA基因的特異性引物來研究其群落結(jié)構(gòu)和豐度就顯得十分必要。

近期研究中，厭氧氨氧化細菌16S rRNA(Amx-16SrRNA)基因的兩對特異性引物(Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R)在研究海洋、河口等生態(tài)環(huán)境中厭氧氨氧化細菌的豐度分布以及群落結(jié)構(gòu)時應(yīng)用較為廣泛[23-26]。據(jù)報道，Amx368F是定向擴增厭氧氨氧化細菌所有屬的前引物，之前的研究發(fā)現(xiàn)，Amx368F可以十分高效地覆蓋厭氧氨氧化細菌[22, 27]，而Brod541F更專注于Ca. Scalindua屬，同時，后引物Amx820R側(cè)重于Ca. Scalindua屬、Ca. Brocadia屬和Ca. Kuenenia屬[3, 5](見表1)。Hong等[23]用Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R兩對引物在南海遠海沉積物中檢測到的厭氧氨氧化細菌均為Ca. Scalindua屬。Hou等[24]用引物Amx368F/Amx820R在長江口潮浸淺灘地沉積物中檢測到Ca. Scalindua,Ca. Brocadia,Ca. Kuenenia三個屬的厭氧氨氧化細菌。Zheng等[25]以引物Amx368F/Amx820R在長江口及鄰近東黃海海域沉積物中檢測到Ca. Scalindua、Ca. Brocadia、Ca. Kuenenia和Ca.Anammoxoglobus四個屬。Chen等[26]以引物Brod541F/Amx820R在德國Scheld-Rhine Meuse三角洲鹽湖Grevelingen湖泊沉積物中檢測到厭氧氨氧化細菌優(yōu)勢類群為Ca. Scalindua屬。

表1 引物名稱、序列及覆蓋范圍

針對以上常用于研究海洋環(huán)境中厭氧氨氧化細菌的兩對特異性引物擴增所得的群落結(jié)構(gòu)差異較大這一現(xiàn)狀，選擇這兩對引物對同一樣品檢測到的厭氧氨氧化細菌群落特征進行比較分析。本研究基于高通量測序結(jié)果對長江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細菌的群落豐度、多樣性信息進行分析，著重分析2對Amx-16S rRNA基因特異性引物對研究海域沉積物中的厭氧氨氧化細菌的覆蓋情況，比較2對引物在研究厭氧氨氧化細菌群落多樣性、豐度分布等群落特征的差異和優(yōu)劣，以期為后期實驗中基因以及引物的選擇提供依據(jù)，為長江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細菌的分子生態(tài)學研究提供指導性參考，從而提高對海洋沉積物中厭氧氨氧化細菌研究的準確性，促進對河口生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程的全面了解。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2011年7月29日—8月4日在長江口鄰近海域(122°E～123.5°E，28°N～32°N)20個站位(見圖1)，采集樣品是深度為0～3 cm的表層沉積物。沉積物樣品放置在無菌封口袋中，用錫箔紙包裹后立即置于液氮中保存，到實驗室后轉(zhuǎn)于-80℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取與引物特異性驗證

用Power Soil DNA Isolation Kit(MO Bio，美國)提取沉積物微生物基因組DNA，于-80℃保存，用于分子生態(tài)學研究。用下列引物(見表2)分別擴增Amx-16S rRNA基因、功能基因hzo片段，并進行回收純化。

1.3 質(zhì)粒標準品與標準曲線的制備以及樣品測定

將目的基因片段連接、轉(zhuǎn)化、測序后制備質(zhì)粒標準品，建立qPCR體系，使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒(Roche, Germany)進行熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)(ABI7500, USA)，并于反應(yīng)體系中加入0.2 μg·μL-1牛血清蛋白，繪制標準曲線。

用引物Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R分別定量Amx-16S rRNA基因的拷貝數(shù)，引物hzo-hzo5F/hzo5R定量hzo基因的拷貝數(shù)，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA 2 μL，引物各0.6 μL，ROX 10 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 6.6 μL，反應(yīng)程序如表2。取2 μL樣品DNA按上述條件進行qPCR實驗，每個DNA樣品設(shè)置3個平行，同時設(shè)置陽性、陰性對照。通過標準曲線換算樣品中Amx-16S rRNA基因2對引物以及功能基因hzo的拷貝數(shù)。

表2 熒光定量PCR引物與反應(yīng)程序

注：Amx-16S rRNA基因的兩對引物均采用兩步法，hzo基因采用三步法，分別進行qPCR實驗。

Note:Two primers of Amx-16s rRNA gene were used in the two-step method andhzogene was used in the three-step method to condact qPCR experiments,respectively.

(圖中陰影部分分別為長江口泥質(zhì)區(qū)、浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)(重繪自秦蘊珊等，1987)。The shaded area means the muddy area in the Changjiang Estuary and Zhejiang-Fujian offshore (repainted by Qin et al., 1987).)

圖1 長江口臨近海域采樣站位示意

Fig.1 Sampling sites in the Changjiang Estuaryandits adjacent area

1.4 454、IlluminaMiseq高通量測序及相關(guān)生物信息分析

用上述兩對引物分別擴增Amx-16S rRNA基因，擴增時在引物5’端加入barcode以區(qū)分不同樣品的序列，構(gòu)建擴增子克隆文庫。由于測序平臺對擴增子目的基因片段長度的要求，針對引物Amx368F/Amx820R采用454測序平臺對沉積物DNA進行雙端(Paired-end)測序，同時對引物Brod541F/Amx820R采用Illumina Miseq PE250測序平臺對沉積物DNA進行雙端測序。將原始下機數(shù)據(jù)進行格式轉(zhuǎn)換后，利用QIIME(Version 1.9.0, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)篩選原始下機序列得到高質(zhì)量序列，用于后續(xù)分析。

使用Uparse軟件[29]對高質(zhì)量序列按97%序列相似度進行OTU聚類，選擇每個OTU的一條序列作為該OTU的代表序列，對代表序列進行物種注釋后，分析物種的相對豐度。利用QIIME軟件分析各個高通量測序樣品的Alpha多樣性，繪制稀釋曲線。將每個OTU代表序列用Mega5.0軟件以鄰接法(Neighbour Joining, NJ)進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.5 基因序列登錄號

基于2對特異性引物(Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R)的高通量測序委托上海派森諾生物科技有限公司進行。本研究獲得的Amx-16S rRNA基因序列在SRA上的登錄號分別為SRP112655:PRJNA394772(Amx368F/Amx820R)和SRP131428:PRJNA431658(Brod541F/Amx820R)。

2 結(jié)果與分析

選取2011年7—8月在東海所采集的4個站位(S13、S20、S31、S33)的表層沉積物樣品作為代表站位，其中S13站位于長江口外泥質(zhì)區(qū)；S20站位于長江口外非泥質(zhì)區(qū)；S31站位于浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)；S33站位于浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)外的外海，厭氧氨氧化細菌的豐度在考察站位中最高。通過厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因的454、Illumina高通量測序?qū)|海表層沉積物中厭氧氨氧化細菌群落特征進行描述。

2.1 厭氧氨氧化細菌群落多樣性比較

將每個沉積物樣品(S13、S20、S31、S33)得到的高質(zhì)量序列，使用QIIME、Uparse等生物信息軟件對序列進行嚴格質(zhì)量控制，對優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度97%進行OTU聚類，選取每個OTU中的最長序列為代表序列。通過GenBank序列比對，結(jié)果表明，質(zhì)控后的序列均為厭氧氨氧化細菌的序列。質(zhì)控后的高質(zhì)量序列條數(shù)和在相似度為97%下進行聚類，得到OTUs數(shù)及覆蓋度分布情況(見表3)。

表3 厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因的兩對引物的多樣性和豐富度參數(shù)

對于同一沉積物樣品，基于2對引物檢測到的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)的比較可以看出，引物Brod541F/Amx820R明顯高于引物Amx368F/Amx820R，從整體趨勢來說，引物Brod541F/Amx820R檢測到的群落豐富度和多樣性都明顯高于引物Amx368F/Amx820R。

在4個表層沉積物樣品中，兩對引物Amx368F/Amx820R(引物1)、Brod541F/Amx820R(引物2)分別獲得92 007、156 931條優(yōu)質(zhì)序列，每個樣品對應(yīng)獲得的序列條數(shù)區(qū)間為(見表3)。以97%序列相似性對上述高質(zhì)量序列進行OTU聚類，并采用RDP Classifier方法將OTU代表序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對、物種注釋，刪除出現(xiàn)頻數(shù)為1(singletons)、無法聚類到OTU的序列。經(jīng)隨機抽樣將測序深度均一化后，每個樣品兩對引物所得的OTUs個數(shù)分別介于54～73、349～2 199之間(見表3)。

Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)分別用于表征群落的多樣性和豐富度情況。Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，其指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高，一般而言，Shannon指數(shù)對群落豐富度以及稀有OTU較為敏感，而Simpson指數(shù)對均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU更為敏感。由表3可知，兩對引物的Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)有較大差別，Brod541F/Amx820R引物的Chao1指數(shù)較大，說明檢測到的厭氧氨氧化細菌菌群的豐富度較高；Brod541F/Amx820R引物的Simpson指數(shù)較大，說明該引物檢測到的細菌菌群的多樣性較高且均勻度較好。在4個樣品每個基因測得序列的覆蓋度均在99%以上，說明本研究所獲得的序列條數(shù)足以覆蓋樣品中厭氧氨氧化細菌的絕大多數(shù)物種信息，而不同站位采用不同引物測得的多樣性和豐富度不同。

如圖2所示，4個樣品的兩對引物的稀釋曲線除引物1的S31站外，均趨于平緩，說明本研究測序條數(shù)足夠，測序深度選取合理。引物1的稀釋曲線是S13站首先趨于平緩，S31站是最后出現(xiàn)平緩趨勢；而對于引物2的情況是，S20站首先趨于平緩，S13站最后出現(xiàn)平緩趨勢，這與表2中的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的高低變化相一致。

2.2 厭氧氨氧化細菌群落組成比較

將引物1通過454平臺和引物2通過Illumina Miseq平臺高通量測序所得OTU代表序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫比對并進行物種注釋，結(jié)果表明，在門分類水平上，引物1測得序列均屬浮霉菌門(Planctomycetes)(見表4)。引物2可以檢測到浮霉菌門(Planctomycetacia)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)等近40個門類的細菌，而不僅僅是浮霉菌門(Planctomycetacia)(見表4)，厭氧氨氧化細菌所在的浮霉菌門(Planctomycetacia)的序列條數(shù)僅占總序列條數(shù)的44.1%。為便于分析，選取豐度最高的前30個OTUs進行后續(xù)的相對豐度與系統(tǒng)發(fā)育分析。

(a、b分別對應(yīng)引物Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R的稀釋曲線。a and b represent the rarefaction curves of Primer Amx368F/Amx820R and Brod541F/Amx820R, respectively.)

圖2 不同引物所得厭氧氨氧化細菌群落的稀釋曲線

在綱分類水平上，浮霉菌綱(Planctomycetacia)在引物1測序所得序列中占絕對優(yōu)勢(>99%)，其他序列約占0～1%，分別屬于α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、Pla3、Pla4和MD2896-B258等(見表4、圖3a)。引物2可以覆蓋到浮霉菌綱(Planctomycetacia)、放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、Pla3、OM190等(見表4、圖3b)。

在屬分類水平，引物1可以檢測到Ca.Scalindua、Ca.Brocadia兩個已知厭氧氨氧化細菌屬，和Oceanicella、W4以及浮霉菌綱的其它未培養(yǎng)厭氧氨氧化細菌(見表4、圖4a)。Ca.Scalindua在每個站位的相對豐度都在90%以上，為測序站位的優(yōu)勢屬，其他屬的厭氧氨氧化細菌相對豐度很低(見表4、圖4b)。

從排名前30的OTUs屬水平上看，引物2可以檢測到的優(yōu)勢菌群中，仍有較多非厭氧氨氧化細菌的菌群。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，已經(jīng)檢測到的厭氧氨氧化細菌有3個已知屬，分別為Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia以及一些未知的厭氧氨氧化細菌，但該對引物還檢測到了許多非厭氧氨氧化菌群的其他微生物類群(見圖5、 6)，通過引物1檢測到的厭氧氨氧化細菌優(yōu)勢屬Ca.Scalindua僅占引物2測序所得總序列條數(shù)的43.7%，Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia的相對豐度約為0.4%。在引物2覆蓋的豐度排名前30的OTUs中，存在大量非厭氧氨氧化細菌類群。因而認為，引物1較適合厭氧氨氧化細菌的分子生態(tài)學研究，而引物2不適合。

2.3 厭氧氨氧化細菌豐度比較

通過上述3對引物研究表層沉積物中厭氧氨氧化細菌豐度分布趨勢，對采樣站位的amx-16S rRNA基因和功能基因hzo進行定量分析，結(jié)果表明，3對引物的分布趨勢一致，厭氧氨氧化細菌豐度分布趨勢大致表現(xiàn)為南部海域大于北部海域，近海海域大于遠海海域(見圖7)。

圖3 引物1(a)、引物2(b)擴增序列在綱分類水平上的相對豐度

圖4 引物1(a)、引物2(b)擴增序列在屬分類水平上的相對豐度

Amx-16S rRNA基因引物1檢測的厭氧氨氧化細菌的豐度最高出現(xiàn)在S33站和最低是S22站；Amx-16S rRNA基因引物2檢測的厭氧氨氧化細菌的豐度最高出現(xiàn)在S31站和最低是S9站；功能基因hzo的豐度結(jié)果是S33站厭氧氨氧化細菌數(shù)最高，S1站最低。由qPCR結(jié)果可知，通過功能基因hzo定量厭氧氨氧化細菌的平均豐度明顯高于Amx-16S rRNA基因2對引物的結(jié)果，且由hzo基因量化的厭氧氨氧化細菌是Amx-16S rRNA基因引物1的2倍(P=0.000< 0.01,r= 0.969)(見圖8)，而與Amx-16S rRNA基因引物2的量化結(jié)果無明顯相關(guān)關(guān)系(P=0.052 > 0.05)。Shimamura等[30]通過富集培養(yǎng)后宏基因測序發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化細菌功能基因hzo有2個基因編碼hzoA和hzoB，厭氧氨氧化細菌基因組中功能基因hzo與16SrRNA基因數(shù)量上的2倍關(guān)系。引物1符合厭氧氨氧化細菌本身的基因數(shù)量關(guān)系。因而引物1更適合應(yīng)用于相關(guān)分子生態(tài)學研究。

圖5 長江口及鄰近海域表層沉積物中厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因(引物1)的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖6 長江口及鄰近海域表層沉積物中厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因(引物2)的系統(tǒng)發(fā)育分析

(圖a、b、c分別對應(yīng)引物Amx368F/Amx820R、Brod541F/ Amx820R、hzo5F/hzo5R覆蓋的厭氧氨氧化細菌的水平分布趨勢。a, b and c represent the horizontal distribution of Anammox bacterial abundance covered by Primer Amx368F/Amx820R, Brod541F/Amx820R and hzo5F/hzo5R, respectively.)

圖7 表層沉積物中厭氧氨氧化細菌豐度(cells/g(濕重))的水平分布
Fig.7 Horizontal distribution of Anammox bacterial abundance (cells/g(Wet weight)) in surface sediments

圖8 Amx-16S rRNA基因(引物1)和hzo基因

3 討論

自上1990年代厭氧氨氧化過程被發(fā)現(xiàn)[1, 31]以來，研究者在多種海洋低氧環(huán)境中[2, 13-14]均發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化細菌。以PCR為基礎(chǔ)的克隆文庫技術(shù)為主流的分子生物學技術(shù)被廣泛應(yīng)用于厭氧氨氧化細菌群落信息的研究，從一定程度上揭示了厭氧氨氧化菌群的多樣性及其在各種生態(tài)環(huán)境中分布的廣泛性。但由于克隆文庫技術(shù)的實驗操作時挑選克隆數(shù)量的限制其測序深度，此種技術(shù)手段所得有效目的片段的序列條數(shù)通常在幾百條，對于環(huán)境樣品中菌群的覆蓋度較低，難以全面闡述菌群的群落多樣性信息。同時，克隆文庫技術(shù)自身的限制可能會使實驗反映的群落信息存在一定的偏向性和偶然性，使獲得的厭氧氨氧化菌群多樣性信息的真實性降低。Dang等[19]、Hou等[24]、Zheng等[25]采用克隆文庫的技術(shù)手段先后對遼東灣及渤海表層沉積物、長江口潮浸淺灘、長江口及鄰近區(qū)域沉積物中厭氧氨氧化菌群分布及多樣性的研究表明，Amx-16S rRNA基因的有效序列條數(shù)在100條以下，覆蓋度在90%左右；Li等[32]研究南海紅樹林沉積物中厭氧氨氧化群落結(jié)構(gòu)多樣性信息時，應(yīng)用克隆文庫技術(shù)檢測到的hzo基因序列的有效條數(shù)在20～60條之間，覆蓋度在80%～100%之間不等，由此可能導致對厭氧氨氧化菌群群落結(jié)構(gòu)信息的分析產(chǎn)生一定的偶然性。

通過不同引物對研究海域沉積物中的厭氧氨氧化細菌豐度分布進行檢測，將所得結(jié)果對數(shù)處理后用單樣本k-s檢驗驗證了3對引物檢測的厭氧氨氧化細菌豐度數(shù)值的正態(tài)性，結(jié)果表明Amx-16S rRNA基因引物1(P=0.958>0.05)、Amx-16S rRNA基因引物2(P=0.718>0.05)和功能基因hzo引物(P=0.299>0.05)檢測到的厭氧氨氧化細菌在研究海域的豐度分布趨勢具有空間異質(zhì)性。用皮爾森(Pearson)相關(guān)性檢驗驗證了不同引物覆蓋厭氧氨氧化細菌豐度分布的相關(guān)性，結(jié)果表明3對引物拷貝數(shù)對數(shù)值具有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01,r1-2=0.613,r1-hzo=0.842,r2-hzo=0.566)，3對引物覆蓋的厭氧氨氧化細菌在研究區(qū)域的分布趨勢大體一致。One-Way ANOVA檢驗結(jié)果也表明厭氧氨氧化細菌的豐度趨勢是一致的(P>0.05)。在所考察區(qū)域，整體表現(xiàn)為長江口處豐度較低，長江口外較遠區(qū)域較高；近岸較低，遠岸較高(見圖7)。對于個別站位，如位于外海非泥質(zhì)區(qū)的S33站位的厭氧氨氧化菌群豐度，Amx-16S rRNA基因引物1和功能基因hzo引物hzo5F/hzo5R表現(xiàn)為所有站位中厭氧氨氧化細菌的豐度最高，Amx-16S rRNA基因引物2則表現(xiàn)為S33站位較泥質(zhì)區(qū)略有降低，引物2檢測到的厭氧氨氧化細菌的分布趨勢與其它2對引物略有不同。且由于Amx-16S rRNA基因引物2擴增的占總量50%左右的序列不是厭氧氨氧化細菌，該對引物較其他2對引物來說不適合用于研究厭氧氨氧化菌群的豐度分布趨勢。

以往研究者大多采用克隆文庫技術(shù)對環(huán)境樣品中的厭氧氨氧化菌群多樣性信息進行分析，覆蓋度之間的不均性，存在一定的不完整性與偶然性。本研究采用454、Illumina高通量測序技術(shù)研究中國邊緣海沉積物中厭氧氨氧化細菌的群落分布情況，高通量測序可獲得的序列條數(shù)在幾萬條。Yang等[33]通過Illumina高通量測序技術(shù)以Amx-16S rRNA基因為目標對淡水湖沉積物進行厭氧氨氧化細菌群落多樣性分析，獲得10 000～30 000條序列，覆蓋度在99.9%～100%之間。Qin等[34]通過Illumina高通量測序技術(shù)以hzsβ基因為目的基因?qū)闯练e物中厭氧氨氧化細菌進行分子生態(tài)學研究，獲得18 000～35 000條序列，較為全面地揭示了湖泊生態(tài)系統(tǒng)中厭氧氨氧化細菌的組成及其對生態(tài)環(huán)境的作用。結(jié)合本研究可知，高通量測序所得序列條數(shù)遠遠高于克隆文庫技術(shù)所得數(shù)值，覆蓋度都能到99%以上，較克隆文庫而言，高通量測序更能全面真實地反映厭氧氨氧化細菌群落的多樣性信息。

目前，已知的厭氧氨氧化細菌都屬于浮霉菌門(Planctomycetes)，共有6個屬，分別是Ca. Scalindua、Ca. Kuenenia、Ca. Brocadia、Ca. Anammoxoglobus、Ca. Jettenia[27]以及Ca. Anammoximicrobiummoscowii[10]。海洋環(huán)境中最常見的屬是Ca. Scalindua。常用于檢測環(huán)境中厭氧氨氧化菌群群落結(jié)構(gòu)的基因是16S rRNA基因，本研究采用Amx-16S rRNA基因的2對引物過去廣泛被克隆文庫技術(shù)利用。引物Amx368F/Amx820R廣泛應(yīng)用于檢測淡水[35]和濱海濕地[36]，水稻田[37-38]以及河口、海洋沉積物[24, 40]中的厭氧氨氧化細菌。就以上研究成果可知，該引物可以覆蓋不同環(huán)境中的Ca. Scalindua、Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia三個屬。厭氧氨氧化細菌在不同生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢屬隨外界環(huán)境因素變化而改變。Dale等[39]應(yīng)用該對引物對Cape Fear河口沉積物中厭氧氨氧化細菌的群落結(jié)構(gòu)研究表明，河口沉積物中厭氧氨氧化菌群優(yōu)勢屬隨鹽度升高由Ca. Brocadia過渡為Ca. Kuenenia，繼續(xù)向外延伸的海洋沉積物中則主要以Ca. Scalindua屬為主。引物Brod541F/Amx820R在過去研究中，更多地應(yīng)用于濱海[40]、海洋[41]沉積物中厭氧氨氧化菌群的研究，可以覆蓋Ca. Scalindua、Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia屬。本章通過3對不同引物檢測到的厭氧氨氧化細菌優(yōu)勢屬也均為Ca. Scalindua，通過Amx-16S rRNA基因引物1檢測到的序列全都是浮霉菌門，覆蓋到厭氧氨氧化細菌的3個已知屬，Amx-16S rRNA基因引物2檢測到浮霉菌門序列所占比例不到50%，有一半以上是其他門類菌群，覆蓋到厭氧氨氧化細菌的3個已知屬。

總體而言，兩對引物檢測到的厭氧氨氧化菌群優(yōu)勢屬均為Ca. Scalindua，能較完整的覆蓋研究區(qū)域的厭氧氨氧化菌群，引物1擴增的序列均為厭氧氨氧化菌群，而引物2擴增結(jié)果中有50%以上的序列不是厭氧氨氧化菌群，因此，Amx-16S rRNA基因引物Amx368F/Amx820R更適合該研究海域的厭氧氨氧化細菌的豐度分布和多樣性特征的分析。

4 結(jié)語

本研究采用454、Illumina高通量測序和qPCR技術(shù)，利用厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因的兩對特異性引物(Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R)對長江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細菌的群落組成、多樣性及豐度進行比較分析，結(jié)果表明，雖然兩對特異性引物均覆蓋到研究海域中厭氧氨氧化細菌的優(yōu)勢屬Ca. Scalindua，但引物Amx368F/Amx820R的特異性優(yōu)于引物Brod541F/Amx820R，該引物更適用于海洋沉積物中厭氧氨氧化細菌的分子生態(tài)學研究。

致謝:感謝中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院張玉博士在軟件使用中提供的幫助！