祁銀燕，鄧 磊，郝廣婧，朱春云

(1 青海大學 農(nóng)林科學院, 西寧 810016；2 青海省農(nóng)林科學院，西寧 810016；3 青海大學 三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室, 西寧 810016；4 青海省高原林木遺傳育種重點實驗室，西寧 810016；5 青海大學，西寧 810016)

青海省柴達木盆地是中國枸杞的原生地之一。盆地獨特的自然環(huán)境和高原氣候孕育出珍稀的植物資源——黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)。它是茄科枸杞屬多年生灌木，生長在嚴重鹽漬化的荒漠地區(qū)，是特有且稀有的緩解土壤鹽堿度和防止土壤荒漠化的多棘刺灌木，對青海偏遠地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定意義重大[1-2]。同時，其黑色漿果在中國和其他亞洲國家已被多年用作傳統(tǒng)中藥材，能提高視力、抗突變、預(yù)防心血管疾病[1,3]等，其營養(yǎng)和藥理價值的發(fā)揮，主要依靠黑果內(nèi)豐富的花青素，其次為維生素、微量元素、多糖和油類物質(zhì)[1-5]等化合物的活性。

但是，在2013～2015年對青海全省黑果枸杞野生資源進行清查時，發(fā)現(xiàn)了整株都是白色漿果的植株。白色果實在顏色表型消失的基礎(chǔ)上，其他使黑果枸杞果實具有營養(yǎng)和藥理價值的活性化合物的含量是否也發(fā)生了變化？因此，本研究以成熟后期3個時期的黒果枸杞白色和黑色漿果為材料，對其表型、花青素、多糖、多酚、礦質(zhì)元素以及維生素E的含量進行了測定和對比分析，為黑果枸杞品種選育、白果的營養(yǎng)價值評判及其適應(yīng)性研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

黑果枸杞果實成熟后期的3個發(fā)育期是果實迅速膨大、花青素等內(nèi)含物大量累積的時期。其中，時期Ⅰ：果實完全著紫色，開始膨大，硬度變??；時期Ⅱ：果實紫黑色，迅速膨大；時期Ⅲ：果實黑色，完全膨大(圖 1)。本研究中，于2016年8月在青海省柴達木盆地格爾木市(36°42′N、95°29′E)500 m2人工黑果枸杞種植地中隨機選取黑果和白果健康植株各20株，一次性取3個不同時期的漿果樣品。每個發(fā)育期用剪刀隨機采集15包樣品，每包大約20～50顆果實，進行后期5個生理指標的檢測，每個指標重復(fù)3次。樣品采集后迅速用錫箔紙包好液氮速凍，儲藏于-80 ℃冰柜備用。

1.2 測定指標及方法

1.2.1花青素含量花青素的測定采用Zeng 等[3]的方法。取約2 g左右的新鮮果實在液氮中充分研磨。取其中500 mg加入5 mL 1%HCl/CH3OH(v/v)。4 ℃黑暗浸提24 h。將混合液在4 ℃、10 000 r/min離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移一個新的10 mL離心管中。向剩余沉淀中加入2 mL 1%HCl/CH3OH(v/v)。重懸后4 ℃黑暗浸提24 h并離心。合并上清液，定容至10 mL。利用0.22 μm微孔過濾膜過濾上清液。用紫外可見光光度計在530 nm處測定。試驗重復(fù)3次。

A、B. 黑果枸杞白色漿果的3個發(fā)育時期(正面和立面)；C、D.黑果枸杞黑色漿果的3個發(fā)育時期(正面和立面)圖1 不同發(fā)育時期(Ⅰ～Ⅲ)的黑果枸杞白色及黑色漿果A, B. The coloration phenotype of white fruit plan and elevation views at different development stages; C, D. The coloration phenotype of black fruit plan and elevation views at different development stagesFig.1 Berries of L. ruthenicum Murr. at different developmental stages(Ⅰ-Ⅲ)

1.2.2多酚含量采用 Folin-Ciocalteau法進行多酚含量的測定。取約2 g左右的鮮果，在電熱鼓風干燥箱中65 ℃干燥48 h。將烘干的果實充分研磨至粉末狀。取其中500 mg左右的粉末于50 mL離心管中。加入25 mL 50%CH3OH溶液，震蕩提取30 min。用超聲波提取40 min，4 ℃、9 000 r/min離心15 min。濾渣用相同提取工藝提取至濾液無表色。合并濾液定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾。取1 mL過濾提取液定容至10 mL。取1 mL稀釋樣品置于25 mL試管中。依次加入5.0 mL蒸餾水、2.5 mL 10% FC試劑。充分震蕩后靜置3 min后，加入4.0 mL 12% Na2CO3溶液搖勻。35 ℃下恒溫水浴1.5 h。顯色后利用紫外可見光光度計在620 nm處測定并計算。試驗重復(fù)3次。

1.2.3多糖含量采用蒽酮-硫酸法進行多糖含量的測定。取約2 g左右的黑果枸杞鮮果，在電熱鼓風干燥箱中65 ℃干燥48 h。將烘干的果實充分研磨至粉末狀，取500 mg粉末于10 mL離心管中。加入5～6 mL 80%乙醇溶液，80 ℃下水浴30 min，期間對其進行震蕩，混合液冷卻后在4 ℃、3 500 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到25 mL離心管中，濾渣用相同提取工藝提取至濾液無表色，重復(fù)浸提2次。合并濾液用80%乙醇溶液定容至25 mL離心管中。吸取2 mL置于10 mL離心管在沸水浴中蒸干，準確加入10 mL蒸餾水，充分攪拌使糖溶解。4 ℃、3 500 r/min離心5 min，取1 mL上清液稀釋30倍。取2 mL稀釋液置于10 mL試管中，將已加入稀釋液的試管放入冰水浴中。將5 mL蒽酮-H2SO4試劑沿試管管壁緩慢加入，待全部加完后混勻冷卻?；旌弦涸嚬芊湃?00 ℃水浴鍋中準確加熱10 min。取出后用自來水冷卻至室溫。紫外可見光光度計在620 nm處測定并計算。試驗重復(fù)3次。

1.2.4礦質(zhì)元素含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)進行元素含量的測定。將干燥處理的黑果枸杞研磨成細粉末。稱取0.2 g干燥樣品置于聚四氟乙烯消解罐。加10 mL濃HNO3進行消化。在將聚四氟乙烯消解罐密封前靜置約2 h。在微波消解系統(tǒng)中進行樣品的溶解。待樣品完全溶解后進行脫酸并用雙蒸餾水進行稀釋后用于測量。樣品溶液通過7500ce電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)系統(tǒng)進行分析。試驗重復(fù)3次。

1.2.5維生素E含量采用高效液相色譜法進行維生素E(VE)活性成分的測定，并以國標GB/T 5009.82-2003)為參照。試驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS18.0對黑果枸杞主要活性成分實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種黑果枸杞果實表型比較

通過對白、黑果成熟后期的果實縱徑、橫徑以及質(zhì)量的測定發(fā)現(xiàn)，枸杞白果、黑果果實縱徑隨著發(fā)育進程而緩慢增加，而果實橫徑在Ⅰ、Ⅱ時期緩慢增加，到第Ⅲ時期急劇增加，導(dǎo)致這一時期的果型指數(shù)相較于前兩個時期的變化不明顯到急劇下降，果型呈現(xiàn)明顯“蟠桃型”，但白果、黑果各發(fā)育時期內(nèi)兩兩比較變化不明顯；白果、黑果的單果重隨著發(fā)育進程不斷增加，而同期內(nèi)兩兩比較差異不大(表1)。以上結(jié)果說明，白果和黑果枸杞果實的發(fā)育進程相近，果型一致，體積、質(zhì)量差異不大，而且果實體積的膨大主要發(fā)生在第Ⅲ時期。

表1 不同發(fā)育時期黑果枸杞漿果的表型性狀

注：表中數(shù)值為3個重復(fù)的平均值，表示為平均值 ± 標準差；相同時期內(nèi)**和*分別代表2種果實間在0.01和0.05水平存在顯著性差異；下同

Note: The figures in table are means of three replicates, and indicated as mean±SD; ** and * within same stage indicated significant differences between white fruit and black fruit as calculated by Duncan statistical analysis at 0.01 and 0.05 level, respectively；The same as below

2.2 2種黑果枸杞果實花青素、多酚和多糖含量的比較

成熟的黑果枸杞黑色漿果中含有豐富的乙?；幕ㄇ嗨豙1,6]。通過對色素大量累積時期的白果和黑果中花青素測定發(fā)現(xiàn)，二者花青素含量在3個時期均存在極顯著性差異(P<0.01)。同時，黑果中的花青素含量隨著果實膨大，從5.50 mg/g迅速增加至17 mg/g，然后有所下降；白果中花青素含量在3個時期均處于很低水平，且基本保持平穩(wěn)(表 2)，花青素的大量消失是其果實顏色呈現(xiàn)白色的原因。

同時，酚類化合物是廣泛存在于高等植物中的活性化合物[7]。作為一類重要的次生代謝物，多酚因為可以保護人體免受氧化危害，比如癌癥、心血管問題、衰老[7-8]等而受到了高度關(guān)注。表2顯示，黑果枸杞黑果和白果中的多酚含量隨果實發(fā)育的變化趨勢相似，都明顯呈現(xiàn)先增加然后有所回落；整體上，白果中也具有可觀的多酚含量，但是黑果中各個時期的多酚含量均明顯高于白果，且在第Ⅰ、Ⅲ時期均存在顯著性差異。

另外，多糖是細胞的4個基本組成部分之一[9]，它被認為是一種主要的抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤的活性物質(zhì)。從表2可知，黑果枸杞白果中雖有多糖的存在，但是其含量在3個時期均顯著低于黑果；白果和黑果中的多糖含量都隨發(fā)育進程而增加，都在第Ⅲ時期達到最大，不同于花青素和多酚含量的表現(xiàn)。

2.3 2種黑果枸杞果實中礦質(zhì)元素含量的比較

礦質(zhì)元素對于人體的發(fā)育必不可少[10]。利用 ICP-MS 測定了2種黑果枸杞果實中17種礦質(zhì)元素

(B, Ca, Co, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, P, Si, Ti, V, Zn, Al)的含量。表3結(jié)果顯示，K、 Na、P、Ca、Mg 是2種黑果枸杞漿果中含量最高的5種元素，尤其是K的含量非常高，是Na含量的5倍之多，其屬于高鉀低鈉的植物。2種漿果間比較，白果中的B、Ca、Li、Mg、Mn、Na、Si含量在3個時期均顯著高于同期的黑果，而其Cu、Fe、Ti的含量在3個時期均低于黑果，且其間Cu、Fe含量存在顯著性差異；漿果中的Co、Cr、P、V 4種元素的含量在黑果和白果中不存在顯著性差異；漿果中的K、Zn和Al含量在黑、白果的發(fā)育過程中一直在波動變化，但是它們在第Ⅲ時期表現(xiàn)為白果含量高于黑果，且兩者間的K含量存在顯著性差異，Zn和Al含量存在極顯著性差異(表3)。

2.4 2種黑果枸杞果實中維生素E含量的比較

維生素E(VE)作為一類人體不能合成、需從外界攝入補充的微量營養(yǎng)元素，在增強人體免疫系統(tǒng)功能方面起著重要作用[11]。維生素E由一組復(fù)合物組成，包括α-(α-Toc)、β-(β-Toc)、γ(γ-Toc)和δ-(δ-Toc) 生育酚和4個相應(yīng)的不飽和衍生物[12]。其中的α-Toc的生理活性最強，是人體最易吸收的生育酚，而γ-Toc的抗氧化能力最強[13]，所以，本研究對黑果枸杞黑、白2種漿果VE中的這2類進行了含量的測定。結(jié)果(表4)表明，黑果枸杞黑、白2種漿果中都有α-Toc、γ-Toc這2類物質(zhì)存在，且α-Toc的含量明顯較于γ-Toc含量豐富。α-Toc的含量在黑、白果中都于第Ⅱ時期比較高，后隨著漿果發(fā)育反而有所下降；黑果中的α-Toc含量在第Ⅱ、Ⅲ時期均顯著高于白果，而在第Ⅰ時期顯著低于白果。γ-Toc的含量整體上處在較低水平，在黑、白果的各發(fā)育時期雖有差異，但差異僅在第Ⅲ時期達到顯著水平，并表現(xiàn)為白果高于黑果。

表2 不同發(fā)育時期2種黑果枸杞漿果中的花青素、多酚、多糖含量

表4 不同發(fā)育時期2種黑果枸杞漿果中的維生素E含量

3 討 論

黑果枸杞廣泛地分布于青藏高原的鹽化荒漠，它特殊的抗旱、抗鹽生理特性對于青海地區(qū)柴達木盆地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定非常重要。強烈紫外線和惡劣土壤環(huán)境誘導(dǎo)黑果枸杞的漿果內(nèi)特異性地積累了大量花青素[4,14]，這種類黃酮物質(zhì)不僅能增強植株自身抗逆性，使其在逆境中正常生長發(fā)育而得以在青海存活[15-19]，還對人體有重要的醫(yī)療保健作用。因此，黑果枸杞是柴達木盆地重要的生態(tài)、經(jīng)濟型樹種，但到目前為止，依舊以野生種為主，優(yōu)良品種缺乏。在品種選育、資源清查過程中，我們發(fā)現(xiàn)了漿果全是白色的黑果枸杞植株。對兩種顏色果實表型的對比分析發(fā)現(xiàn)，二者除了果色不同外，沒有差異。

果色是果實品質(zhì)的重要指標，花青素是決定果色的主要色素，也是果實成熟的主要標志。對于水果、蔬菜和糧食作物來說，傳統(tǒng)品種多為淡色?；ㄇ嗨仉m然因其抗氧化性對人類具有保健功能，但它們會使口感偏澀[20-21]。近年來，隨著人類心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌癥的頻發(fā)，花青素的保健功能已經(jīng)引起了人們的重視。這種類黃酮物質(zhì)，對于植株本身而言，能增強自身抗逆性，能使其在逆境中正常生長發(fā)育[17-19]。因此，花青素是黑果枸杞漿果內(nèi)最重要和最具有生態(tài)價值和經(jīng)濟價值的內(nèi)含物[1]。本研究中黑色鮮漿果內(nèi)花青素的含量在發(fā)育第Ⅱ時期高達17.18 mg/g，遠高于已報道的其他深色果實，其花青素含量是越桔屬(Vaccinium) 30 個基因型的1.8～27.6倍，是懸鉤子屬(Rubus) 37 種和栽培種的1.5～18倍，是虎耳草科(Ribes) 40個基因型的2.3～66.9倍[22]。這在可食用漿果中非常罕見[23]。但是，黑果枸杞白色果實中花青素含量在3個時期均極低，且趨于平穩(wěn)，說明花青素的大量消失是果實顏色呈現(xiàn)白色的根本原因?；ㄇ嗨胤e累的完全阻斷很可能會降低植株抗逆性，使其適應(yīng)柴達木盆地惡劣環(huán)境的能力受限，對漿果品質(zhì)的影響也是致命的。眾多研究已表明，從無色向紅紫色品種轉(zhuǎn)變常由花青素調(diào)控因子MYB或b HLH的表達上調(diào)引起，而紅紫色向淡色轉(zhuǎn)變可由多種機制引起，如任意一個花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因或相關(guān)調(diào)控因子的突變。自然界相同環(huán)境條件下形成的淡色突變品種中，調(diào)控基因MYB和結(jié)構(gòu)基因F3′H與F3′5′H的突變出現(xiàn)頻率較高[21]。下一步我們將會利用轉(zhuǎn)錄組深度測序?qū)诠坭筋伾x機理進行系統(tǒng)研究，結(jié)合適應(yīng)性的長期監(jiān)測，以期從分子水平揭開黒果枸杞黑色漿果花青素累積與白色漿果顏色缺失的機理，并闡明花青素的多寡對其適應(yīng)性的影響。同時，多酚、多糖、元素和維生素E也是黑果枸杞漿果發(fā)揮保健功能的重要內(nèi)含物[1-2]。通過對比發(fā)現(xiàn)這些活性物質(zhì)在黑、白果中都存在、都有各自的優(yōu)勢值，且都在果實發(fā)育的第Ⅱ、Ⅲ時期中含量達到最高，而多酚、多糖和VE的含量在白果中雖然也很可觀，但在各個時期均顯著低于黑色果實；但值得關(guān)注的是，多種礦質(zhì)元素含量則在白果中表現(xiàn)比較佳。

在今天，消費者追求多功能食物和果實品質(zhì)。黑果枸杞白色果實相較于黑色果實，遜色于健康促進(花青素、多糖、多酚)和營養(yǎng)價值(維生素E)，但是天然存在的白色形式具有極高的科研價值，它為深刻理解苛刻的高原環(huán)境下復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和特定的生化特性，尤其為花青素高效累積下的深色顏色的形成以及花青素與適應(yīng)性之間的關(guān)系提供了珍貴材料。