逆境脅迫對(duì)菜豆黃化苗轉(zhuǎn)綠過程中交替呼吸途徑與葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/h1>
2019-01-04 02:08蘆麗娜冉瑞蘭馮漢青
西北植物學(xué)報(bào) 2018年11期
蘆麗娜,冉瑞蘭，馮漢青
(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 蘭州 730070)
鉛(Pb)在土壤、水源中廣泛存在，其通過吸收進(jìn)入植物體內(nèi)而對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害，被認(rèn)為是一種主要的植物重金屬毒性物質(zhì)[1]。已有研究表明，鉛脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性的改變、線粒體及細(xì)胞核等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞、抗壞血酸含量減少、硝酸還原酶和脫氫酶等酶活力降低以及DNA的損傷；此外，鉛脅迫能阻止Ca2+的跨膜內(nèi)流，使鈣調(diào)素和Ca-ATP酶無法被激活，并抑制有絲分裂的進(jìn)行，甚至導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡[2-3]。同時(shí)，高溫、干旱、鹽漬等諸多逆境均會(huì)導(dǎo)致植物遭受滲透脅迫，其被認(rèn)為是限制植物正常生長發(fā)育的主要環(huán)境因素[4]。而滲透脅迫也會(huì)破壞植物細(xì)胞生物膜系統(tǒng)，改變膜的透性，導(dǎo)致植物細(xì)胞核和線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的破壞；此外，滲透脅迫還會(huì)引起植物細(xì)胞離子外漏，影響生物大分子生物合成，改變飽和脂肪酸含量，阻礙根系生長和營養(yǎng)吸收，從而嚴(yán)重影響植物的正常生長[5]。
在高等植物中，線粒體呼吸存在兩條不同的途徑：細(xì)胞色素途徑和交替呼吸途徑[6]。交替氧化酶是存在于植物細(xì)胞線粒體交替呼吸途徑的末端氧化酶，交替呼吸途徑可以使電子從泛醌處分支，繞過線粒體電子傳遞鏈中的兩個(gè)ATP形成位點(diǎn)(復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ)，直接由交替氧化酶催化分子氧的4個(gè)電子還原成水[7-8]。因此，與細(xì)胞色素途徑相比，交替呼吸途徑的運(yùn)行減少了ATP的產(chǎn)生，而將本應(yīng)生成ATP的能量以熱的形式釋放[9]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界環(huán)境對(duì)植物造成脅迫時(shí)，交替呼吸途徑能夠通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生、維持呼吸的運(yùn)行、加速碳骨架的供應(yīng)等多種方式降低環(huán)境脅迫對(duì)植物造成的壓力[6-9]。
黑暗下生長的黃化狀態(tài)的幼苗通過光照轉(zhuǎn)綠是一個(gè)涉及到葉綠素生物合成、光合機(jī)構(gòu)裝配和葉綠體發(fā)育的過程[10-11]。植物黃化幼苗為研究外在環(huán)境和內(nèi)部因素對(duì)植物葉綠素合成以及光合機(jī)構(gòu)建成的影響等工作提供了良好的材料[12]。有研究表明，鉛或滲透脅迫均可以影響正常生長的植物的葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)[3,5,13]，但對(duì)于在植物黃化葉片轉(zhuǎn)綠過程中Pb或滲透脅迫對(duì)于植物葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)的影響鮮有報(bào)道。另據(jù)報(bào)道，交替呼吸途徑能夠調(diào)節(jié)植物的葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)[14-15]。然而，在鉛或滲透脅迫影響黃化狀態(tài)植物轉(zhuǎn)綠的過程中，交替呼吸途徑所起的生理學(xué)角色在國內(nèi)外尚無研究。
基于此，本研究以菜豆黃化幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，以葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的衡量指標(biāo)，探討了在Pb脅迫或PEG誘導(dǎo)的滲透脅迫下交替呼吸途徑對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，該工作有助于進(jìn)一步了解和豐富在逆境脅迫下植物交替呼吸途徑的生理學(xué)作用。
1 材料和方法
1.1 材料培養(yǎng)
本試驗(yàn)所用菜豆(PhaseolusvulgarisL.)品種為‘農(nóng)普12號(hào)’，種子由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。使用W/V為1% 的 NaClO溶液對(duì)菜豆種子表面消毒10～15 min，之后充分沖洗(清除殘留的NaClO)。將用蒸餾水浸濕的多層紗布覆蓋于培養(yǎng)皿中，再將已消毒的種子置于紗布中覆蓋，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱于26 ℃黑暗下進(jìn)行萌發(fā)。選取萌發(fā)均一的種子在含有Hoagland培養(yǎng)液的錐形瓶中于26 ℃下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，每2 d更換營養(yǎng)液1次。
1.2 材料處理
選取8 d齡，長勢(shì)均一的菜豆黃化幼苗作為供試材料，并進(jìn)行如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)處理，分別在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2光照0、24、48、72 h時(shí)測(cè)量葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，且分別在實(shí)驗(yàn)1光照0 h、24 h、72 h時(shí)測(cè)量交替呼吸途徑容量。
實(shí)驗(yàn)1：以Hoagland 培養(yǎng)液為溶劑，配制0、0.3、0.6、1 mmol/L的Pb(NO3)2溶液，或以Hoagland培養(yǎng)液為溶劑，配制0、5%、10%、15%的PEG-6000溶液。將黃化幼苗置于上述溶液中于黑暗下預(yù)處理12 h(溫度26 ℃)，之后在26 ℃下給予光強(qiáng)為(170±30) μmol·m-2·s-1光照72 h。
實(shí)驗(yàn)2：配制1 mmol/L 的水楊基氧肟酸(salicylhydroxamic acid，SHAM，交替氧化酶的抑制劑)，溶劑為質(zhì)量體積比為1%的乙醇。用1 mmol/L的SHAM或1%的乙醇噴灑葉片，于黑暗中孵育4 h，之后移入含有或不含有0.3 mmol/L的 Pb(NO3)2的Hoagland營養(yǎng)液中，或移入含有5% PEG-6000的Hoagland營養(yǎng)液中，然后將上述溶液中黃化幼苗置于黑暗下預(yù)處理12 h(溫度26 ℃)，后在26 ℃下給予光強(qiáng)為(170±30) μmol·m-2·s-1光照72 h。
1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.3.1葉綠素含量參考李祖祥等[16]的方法并略加修改，將研磨提取法修改為暗處丙酮浸泡提取法，以減少葉綠素在提取過程中的損耗。具體方法：稱取葉片材料0.05 g，剪碎，加入3 mL 80%(體積比)丙酮提取液，暗處浸提過夜，用分光光度計(jì)分別測(cè)定在663 nm和645 nm下光吸收值，空白對(duì)照為80%(體積比)丙酮。
1.3.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)使用葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM(Waltz, Germany)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。將待測(cè)葉片經(jīng)過充分的暗適應(yīng)后，打開測(cè)量光，測(cè)定初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)，之后打開光化光，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光(Fs)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后打開飽和脈沖光，測(cè)得最大熒光(Fm′)，關(guān)閉光化光，在遠(yuǎn)紅光下測(cè)得最小熒光(Fo′)。根據(jù)以上參數(shù)計(jì)算出潛在最大光化學(xué)量子效率[Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm)]、最大光化學(xué)效率 [Fv′/Fm′ =(Fm′-Fo′)/Fm′)]、實(shí)際光化學(xué)效率 [Y(Ⅱ)=(Fm′-Ft)/Fm′]、光化學(xué)猝滅系數(shù) [qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)]和非光化學(xué)猝滅系數(shù)[NPQ=Fm/Fm′-1]等參數(shù)。
1.3.3交替呼吸途徑容量交替呼吸途徑容量的測(cè)定參照Clark型氧電極方法[17]進(jìn)行：將葉片材料剪碎，在KCN存在下測(cè)量葉片耗氧速率；并在KCN和SHAM共同存在下測(cè)量剩余呼吸，交替呼吸途徑容量為在KCN存在下測(cè)得的葉片耗氧速率與剩余呼吸的差值。
1.4 數(shù)據(jù)分析
上述檢測(cè)均為4次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，采用Excel和Origin統(tǒng)計(jì)軟件完成試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)處理：計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、顯著性差異檢驗(yàn)(t-檢測(cè)，a=0.05)，并完成圖表繪制工作。
2 結(jié)果及分析
2.1 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響
圖1顯示，在經(jīng)歷24、48、72 h光照后，各濃度Pb或PEG脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均比照光前明顯上升；隨著光照時(shí)間延長，對(duì)照(CK)、各濃度Pb脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均逐漸增加，而各濃度PEG脅迫處理的葉綠素含量均逐漸降低；在相同光照時(shí)間內(nèi)，各濃度Pb或PEG脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均比相應(yīng)對(duì)照顯著降低，且脅迫濃度越高下降幅度越大。其中，在光照72 h 后，菜豆黃化幼苗葉片的葉綠素含量在 0.3、0.6、1.0 mmol/L的Pb(NO3)2脅迫下分別比同期對(duì)照(CK)顯著降低了22.73%、34.18%和55.8%，而在5%、10%、15%的PEG脅迫下分別比同期對(duì)照顯著降低89.4%、91.22%和92.267%(P<0.05)。上述結(jié)果表明，Pb或者PEG脅迫下菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素的合成受到顯著抑制；隨著脅迫濃度的增大和時(shí)間的延長，葉綠素的合成受到抑制越嚴(yán)重，且PEG脅迫對(duì)葉綠素含量的影響趨勢(shì)顯著強(qiáng)于Pb(NO3)2脅迫。
2.2 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由表1、2可知，在經(jīng)歷24、48、72 h光照后，Pb或PEG脅迫黃化菜豆幼苗葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP、NPQ均較照光前(0 h光照)大幅度增加。在光照24 h后，隨光照時(shí)間繼續(xù)增加，正常轉(zhuǎn)綠的葉片(CK)的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP均持續(xù)增加，而其NPQ則逐漸降低；各濃度Pb或PEG脅迫處理葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP隨光照時(shí)間繼續(xù)增加均逐漸降低，而其 NPQ 則持續(xù)增加。在相同光照時(shí)間內(nèi)，與正常轉(zhuǎn)綠的葉片(CK)相比，各濃度Pb或者PEG脅迫黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉片F(xiàn)v/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP數(shù)值均顯著下降，但NPQ數(shù)值同時(shí)顯著增加，且脅迫濃度越高各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的升降幅度越大。其中，在光照72h后，0．3、0．6、1mmol/L的Pb(NO3)2 溶液處理菜豆幼 苗 葉 片 Fv/Fm 分 別 比 對(duì) 照 (CK)顯 著 降 低27．3%、35．79% 和 36．4%，F(xiàn)v′/Fm′分 別降低12．43%、16．13%和24．7%，Y(Ⅱ)分別降低27．71%、34．47%和44．8%，qP分別降低25．13%、31．57%和39．86%，而NPQ分別顯著增加222%、283%和413%(P<0．05)；同時(shí)，在光照72h后，5%、10%、15%的PEG脅迫菜豆葉片的Fv/Fm分別比對(duì)照(CK)顯著降低31．48%、39．61%和48．09%，F(xiàn)v′/Fm′分別顯著降低46．29%、50．39%和55．42%，Y(Ⅱ)分別顯著降低54．82%、45．78%和74．31%，qP分別顯著降低38．20%、60．28%、67．94%，但NPQ分別顯著增加257%、395．7%和514%(P<0．05)。以上結(jié)果說明Pb或PEG脅迫會(huì)引起菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中PSⅡ開放程度的降低，對(duì)電子的接受、傳遞能力下降，抑制 PSⅡ?qū)饽艿奈找约斑\(yùn)行效率，使得更多的光能無法被利用，而是以熱的形式耗散掉，即 Pb或 PEG 脅迫顯著降低了 PSⅡ?qū)饽艿睦寐省?/p>
同期不同小寫字母表示處理之間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)；以下圖表同。圖1 不同濃度Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素含量的變化Different lower cases with the same time indicate significant differences between treatments at 0.05 level (P<0.05); the same as below table and figuresFig.1 The change of chlorophyll content in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2 (A)or PEG(B) stress
表1 Pb(NO3)2脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
注：Fv/Fm. PSⅡ潛在最大光化學(xué)量子效率;Fv′/Fm′.光適應(yīng)下最大光化學(xué)效率; Y(Ⅱ).PSⅡ光適應(yīng)下實(shí)際光化學(xué)效率;qP.光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)；NPQ.非光化學(xué)猝滅系數(shù)；下同
Note:Fv/Fm. The potential maximal photochemical efficiency of PSⅡ;Fv′/Fm′. The maximum quantum efficiency of PSⅡ photochemistry at illumination; Y(Ⅱ). Effective photochemical quantum yield of PSⅡphotochemistry at illumination;qP. Photochemical quenching coefficient; NPQ. Non-photochemical quenching; The same as below
表2 PEG脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
2.3 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中交替呼吸途徑容量的影響
由圖2可看出，在經(jīng)歷24、72 h光照后，各處理黃化的菜豆幼苗葉片交替呼吸途徑容量均比照光前(0 h)大幅上升，且光照時(shí)間越長增幅越大。在相同光照時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)綠過程中菜豆黃化幼苗葉片交替呼吸途徑容量隨著Pb(NO3)2濃度的升高而逐漸增加，而隨著PEG脅迫濃度的增加而先上升后降低，并在10%PEG脅迫下達(dá)到最大值，且各濃度Pb或者PEG脅迫處理均顯著高于同期對(duì)照(CK)。其中，經(jīng)72 h光照后，菜豆黃化幼苗葉片抗氰呼吸途徑容量在0.3、0.6、1 mmol/L的Pb(NO3)2脅迫處理下分別比對(duì)照顯著增加632.8%、816.6%、1 065%、1 129.6%，在5%、10%、15% PEG脅迫下分別顯著上升479.9%、555%、629.6%、374.8%。以上結(jié)果說明不同濃度的Pb或PEG脅迫均顯著增加了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉片交替呼吸途徑容量。
2.4 Pb或PEG脅迫下SHAM對(duì)黃化葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響
為了研究在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響，我們分別在0.3 mmol/L Pb(NO3)2和5% PEG脅迫下考察了交替呼吸途徑抑制劑SHAM(1 mmol/L)處理葉片在轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的變化。圖3顯示，在菜豆幼苗葉片正常(無脅迫)轉(zhuǎn)綠過程中，單獨(dú)經(jīng)過SHAM處理(1 mmol/L)的葉片葉綠素含量未受到顯著影響。然而，Pb(NO3)2+SHAM處理均使黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量比Pb(NO3)2脅迫處理顯著下降，且降幅隨光照時(shí)間的延長進(jìn)一步加大。相似地，PEG脅迫下，PEG+ SHAM處理也使得黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量比PEG脅迫處理進(jìn)一步顯著下降，并以PEG+ SHAM處理降幅更大，且下降幅度隨光照時(shí)間的延長而加劇。另外，隨著脅迫濃度的增大及時(shí)間的延長，PEG脅迫下交替呼吸途徑對(duì)黃化菜豆葉片葉綠素含量的影響程度顯著高于相應(yīng)Pb脅迫。以上結(jié)果說明Pb(NO3)2或PEG脅迫下交替呼吸途徑受到的抑制導(dǎo)致了黃化菜豆幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量進(jìn)一步下降，因此交替呼吸途徑在植物細(xì)胞內(nèi)很有可能是通過調(diào)節(jié)葉綠素的含量來促進(jìn)植物在環(huán)境脅迫下維持PSⅡ正常運(yùn)行。
2.5 Pb或PEG脅迫下SHAM對(duì)菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由表3、4可知，菜豆黃化幼苗正常轉(zhuǎn)綠過程中，單獨(dú)1 mmol/L SHAM處理均沒有使得葉片各葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生顯著變化；在Pb或者PEG脅迫下，SHAM處理使得黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)和qP均比相應(yīng)的Pb或者PEG脅迫處理顯著下降，而同期卻均NPQ則顯著上升，且各參數(shù)的升降幅度隨著光照時(shí)間的延長而加大。以上結(jié)果說明抑制交替呼吸途徑會(huì)加劇Pb或PEG脅迫對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心活性的進(jìn)一步抑制，還原力的積累加劇，造成熱耗散進(jìn)一步增加，這可能暗示在脅迫條件下交替呼吸途徑是有助于緩解PSⅡ的過度還原，幫助維持其正常運(yùn)行。
圖2 Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片交替呼吸途徑容量的變化Fig.2 The capacity of alternative respiratory pathways in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2 (A)or PEG(B) stress
圖3 Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素含量的影響Fig.3 The effects of SHAM treatment on chlorophyll content in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2(A) or PEG(B) stress
表3 Pb(NO3)2脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
表4 PEG脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
3 討 論
許多研究表明，環(huán)境脅迫會(huì)影響正常生長的植物葉綠素的合成和光化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行[18-21]。同時(shí)，在環(huán)境脅迫下， PSⅡ比PSⅠ更易受到環(huán)境脅迫的損傷，其運(yùn)行水平的下降是植物光化學(xué)反應(yīng)能力在環(huán)境脅迫下降低的主要原因[22-23]。本研究顯示，較之正常轉(zhuǎn)綠的菜豆黃化幼苗，Pb或PEG脅迫導(dǎo)致黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量、Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)明顯下降，同時(shí)NPQ顯著增加。這一觀察結(jié)果表明，黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中，Pb或PEG脅迫阻礙了葉綠素的合成，降低了PSⅡ的容量和運(yùn)行水平。以前的研究發(fā)現(xiàn)，光合電子傳遞鏈中原初電子受體還原性的增加會(huì)阻礙光合電子傳遞鏈相關(guān)蛋白以及葉綠素合成酶等重要蛋白質(zhì)向質(zhì)體的輸入[14-15]。qP反映了光合電子傳遞鏈原初電子受體氧化還原狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，Pb或PEG脅迫均導(dǎo)致了黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中qP明顯下降，表明Pb或PEG脅迫增加了轉(zhuǎn)綠過程中光合電子傳遞鏈原初電子受體的還原性。因此，Pb或PEG脅迫導(dǎo)致的轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素合成受阻以及PSⅡ容量和運(yùn)行水平的下降可能均與光合電子傳遞鏈中原初電子受體還原性的增加有關(guān)。
同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)，在菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程中，交替呼吸途徑的容量隨著光照時(shí)間而不斷上升，而Pb(NO3)2或PEG脅迫使得交替呼吸途徑的容量進(jìn)一步增加。為了進(jìn)一步查明在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑與轉(zhuǎn)綠過程的關(guān)系，我們比較了在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑的抑制劑SHAM對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)水平的影響。本實(shí)驗(yàn)室之前工作顯示，對(duì)菜豆葉片噴灑1 mmol/L的SHAM可有效抑制其交替呼吸途徑的水平[24-25]。在無脅迫條件下，對(duì)菜豆黃化幼苗葉片施加1 mmol/L SHAM并未引起黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)水平的顯著性變化；而在Pb或PEG脅迫下，對(duì)菜豆黃化幼苗葉片施加1 mmol/L SHAM導(dǎo)致了其葉綠素含量、Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)和qP的進(jìn)一步下降和NPQ的進(jìn)一步增加。表明在Pb或PEG脅迫下，抑制交替呼吸途徑會(huì)加劇Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆葉綠素合成的抑制，并導(dǎo)致了PSⅡ的容量和運(yùn)行水平的進(jìn)一步下降和PSⅡ反應(yīng)中心非還原性QB相對(duì)比例的進(jìn)一步增加。有研究發(fā)現(xiàn)，植物能夠通過蘋果酸穿梭途徑以及光呼吸途徑將葉綠體中過多的還原性物質(zhì)(如NADPH)轉(zhuǎn)移至線粒體中，并通過交替呼吸途徑將這些還原性物質(zhì)消耗掉，從而有效阻止了質(zhì)體中過多還原性物質(zhì)的積累，降低了光合電子傳遞鏈的還原性[26-27]。據(jù)此我們推測(cè)，當(dāng)Pb或PEG脅迫阻礙了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程時(shí)，交替呼吸途徑水平的增加能夠通過緩解光合電子傳遞鏈的過度還原而使得葉綠素合成酶等重要蛋白質(zhì)向質(zhì)體的輸入維持在一定的水平，從而緩解了Pb或PEG脅迫對(duì)幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的阻礙作用。但具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究。綜上，Pb或PEG脅迫阻礙了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程，而交替呼吸途徑可在一定程度上緩解Pb或PEG脅迫對(duì)轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的不良影響。
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蘆麗娜,冉瑞蘭，馮漢青
(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 蘭州 730070)
鉛(Pb)在土壤、水源中廣泛存在，其通過吸收進(jìn)入植物體內(nèi)而對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害，被認(rèn)為是一種主要的植物重金屬毒性物質(zhì)[1]。已有研究表明，鉛脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性的改變、線粒體及細(xì)胞核等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞、抗壞血酸含量減少、硝酸還原酶和脫氫酶等酶活力降低以及DNA的損傷；此外，鉛脅迫能阻止Ca2+的跨膜內(nèi)流，使鈣調(diào)素和Ca-ATP酶無法被激活，并抑制有絲分裂的進(jìn)行，甚至導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡[2-3]。同時(shí)，高溫、干旱、鹽漬等諸多逆境均會(huì)導(dǎo)致植物遭受滲透脅迫，其被認(rèn)為是限制植物正常生長發(fā)育的主要環(huán)境因素[4]。而滲透脅迫也會(huì)破壞植物細(xì)胞生物膜系統(tǒng)，改變膜的透性，導(dǎo)致植物細(xì)胞核和線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的破壞；此外，滲透脅迫還會(huì)引起植物細(xì)胞離子外漏，影響生物大分子生物合成，改變飽和脂肪酸含量，阻礙根系生長和營養(yǎng)吸收，從而嚴(yán)重影響植物的正常生長[5]。
在高等植物中，線粒體呼吸存在兩條不同的途徑：細(xì)胞色素途徑和交替呼吸途徑[6]。交替氧化酶是存在于植物細(xì)胞線粒體交替呼吸途徑的末端氧化酶，交替呼吸途徑可以使電子從泛醌處分支，繞過線粒體電子傳遞鏈中的兩個(gè)ATP形成位點(diǎn)(復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ)，直接由交替氧化酶催化分子氧的4個(gè)電子還原成水[7-8]。因此，與細(xì)胞色素途徑相比，交替呼吸途徑的運(yùn)行減少了ATP的產(chǎn)生，而將本應(yīng)生成ATP的能量以熱的形式釋放[9]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界環(huán)境對(duì)植物造成脅迫時(shí)，交替呼吸途徑能夠通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生、維持呼吸的運(yùn)行、加速碳骨架的供應(yīng)等多種方式降低環(huán)境脅迫對(duì)植物造成的壓力[6-9]。
黑暗下生長的黃化狀態(tài)的幼苗通過光照轉(zhuǎn)綠是一個(gè)涉及到葉綠素生物合成、光合機(jī)構(gòu)裝配和葉綠體發(fā)育的過程[10-11]。植物黃化幼苗為研究外在環(huán)境和內(nèi)部因素對(duì)植物葉綠素合成以及光合機(jī)構(gòu)建成的影響等工作提供了良好的材料[12]。有研究表明，鉛或滲透脅迫均可以影響正常生長的植物的葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)[3,5,13]，但對(duì)于在植物黃化葉片轉(zhuǎn)綠過程中Pb或滲透脅迫對(duì)于植物葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)的影響鮮有報(bào)道。另據(jù)報(bào)道，交替呼吸途徑能夠調(diào)節(jié)植物的葉綠素合成和光化學(xué)反應(yīng)[14-15]。然而，在鉛或滲透脅迫影響黃化狀態(tài)植物轉(zhuǎn)綠的過程中，交替呼吸途徑所起的生理學(xué)角色在國內(nèi)外尚無研究。
基于此，本研究以菜豆黃化幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，以葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的衡量指標(biāo)，探討了在Pb脅迫或PEG誘導(dǎo)的滲透脅迫下交替呼吸途徑對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，該工作有助于進(jìn)一步了解和豐富在逆境脅迫下植物交替呼吸途徑的生理學(xué)作用。
1 材料和方法
1.1 材料培養(yǎng)
本試驗(yàn)所用菜豆(PhaseolusvulgarisL.)品種為‘農(nóng)普12號(hào)’，種子由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。使用W/V為1% 的 NaClO溶液對(duì)菜豆種子表面消毒10～15 min，之后充分沖洗(清除殘留的NaClO)。將用蒸餾水浸濕的多層紗布覆蓋于培養(yǎng)皿中，再將已消毒的種子置于紗布中覆蓋，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱于26 ℃黑暗下進(jìn)行萌發(fā)。選取萌發(fā)均一的種子在含有Hoagland培養(yǎng)液的錐形瓶中于26 ℃下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，每2 d更換營養(yǎng)液1次。
1.2 材料處理
選取8 d齡，長勢(shì)均一的菜豆黃化幼苗作為供試材料，并進(jìn)行如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)處理，分別在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2光照0、24、48、72 h時(shí)測(cè)量葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，且分別在實(shí)驗(yàn)1光照0 h、24 h、72 h時(shí)測(cè)量交替呼吸途徑容量。
實(shí)驗(yàn)1：以Hoagland 培養(yǎng)液為溶劑，配制0、0.3、0.6、1 mmol/L的Pb(NO3)2溶液，或以Hoagland培養(yǎng)液為溶劑，配制0、5%、10%、15%的PEG-6000溶液。將黃化幼苗置于上述溶液中于黑暗下預(yù)處理12 h(溫度26 ℃)，之后在26 ℃下給予光強(qiáng)為(170±30) μmol·m-2·s-1光照72 h。
實(shí)驗(yàn)2：配制1 mmol/L 的水楊基氧肟酸(salicylhydroxamic acid，SHAM，交替氧化酶的抑制劑)，溶劑為質(zhì)量體積比為1%的乙醇。用1 mmol/L的SHAM或1%的乙醇噴灑葉片，于黑暗中孵育4 h，之后移入含有或不含有0.3 mmol/L的 Pb(NO3)2的Hoagland營養(yǎng)液中，或移入含有5% PEG-6000的Hoagland營養(yǎng)液中，然后將上述溶液中黃化幼苗置于黑暗下預(yù)處理12 h(溫度26 ℃)，后在26 ℃下給予光強(qiáng)為(170±30) μmol·m-2·s-1光照72 h。
1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.3.1葉綠素含量參考李祖祥等[16]的方法并略加修改，將研磨提取法修改為暗處丙酮浸泡提取法，以減少葉綠素在提取過程中的損耗。具體方法：稱取葉片材料0.05 g，剪碎，加入3 mL 80%(體積比)丙酮提取液，暗處浸提過夜，用分光光度計(jì)分別測(cè)定在663 nm和645 nm下光吸收值，空白對(duì)照為80%(體積比)丙酮。
1.3.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)使用葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM(Waltz, Germany)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。將待測(cè)葉片經(jīng)過充分的暗適應(yīng)后，打開測(cè)量光，測(cè)定初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)，之后打開光化光，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光(Fs)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后打開飽和脈沖光，測(cè)得最大熒光(Fm′)，關(guān)閉光化光，在遠(yuǎn)紅光下測(cè)得最小熒光(Fo′)。根據(jù)以上參數(shù)計(jì)算出潛在最大光化學(xué)量子效率[Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm)]、最大光化學(xué)效率 [Fv′/Fm′ =(Fm′-Fo′)/Fm′)]、實(shí)際光化學(xué)效率 [Y(Ⅱ)=(Fm′-Ft)/Fm′]、光化學(xué)猝滅系數(shù) [qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)]和非光化學(xué)猝滅系數(shù)[NPQ=Fm/Fm′-1]等參數(shù)。
1.3.3交替呼吸途徑容量交替呼吸途徑容量的測(cè)定參照Clark型氧電極方法[17]進(jìn)行：將葉片材料剪碎，在KCN存在下測(cè)量葉片耗氧速率；并在KCN和SHAM共同存在下測(cè)量剩余呼吸，交替呼吸途徑容量為在KCN存在下測(cè)得的葉片耗氧速率與剩余呼吸的差值。
1.4 數(shù)據(jù)分析
上述檢測(cè)均為4次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，采用Excel和Origin統(tǒng)計(jì)軟件完成試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)處理：計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、顯著性差異檢驗(yàn)(t-檢測(cè)，a=0.05)，并完成圖表繪制工作。
2 結(jié)果及分析
2.1 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響
圖1顯示，在經(jīng)歷24、48、72 h光照后，各濃度Pb或PEG脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均比照光前明顯上升；隨著光照時(shí)間延長，對(duì)照(CK)、各濃度Pb脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均逐漸增加，而各濃度PEG脅迫處理的葉綠素含量均逐漸降低；在相同光照時(shí)間內(nèi)，各濃度Pb或PEG脅迫處理黃化菜豆葉片葉綠素含量均比相應(yīng)對(duì)照顯著降低，且脅迫濃度越高下降幅度越大。其中，在光照72 h 后，菜豆黃化幼苗葉片的葉綠素含量在 0.3、0.6、1.0 mmol/L的Pb(NO3)2脅迫下分別比同期對(duì)照(CK)顯著降低了22.73%、34.18%和55.8%，而在5%、10%、15%的PEG脅迫下分別比同期對(duì)照顯著降低89.4%、91.22%和92.267%(P<0.05)。上述結(jié)果表明，Pb或者PEG脅迫下菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素的合成受到顯著抑制；隨著脅迫濃度的增大和時(shí)間的延長，葉綠素的合成受到抑制越嚴(yán)重，且PEG脅迫對(duì)葉綠素含量的影響趨勢(shì)顯著強(qiáng)于Pb(NO3)2脅迫。
2.2 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由表1、2可知，在經(jīng)歷24、48、72 h光照后，Pb或PEG脅迫黃化菜豆幼苗葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP、NPQ均較照光前(0 h光照)大幅度增加。在光照24 h后，隨光照時(shí)間繼續(xù)增加，正常轉(zhuǎn)綠的葉片(CK)的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP均持續(xù)增加，而其NPQ則逐漸降低；各濃度Pb或PEG脅迫處理葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP隨光照時(shí)間繼續(xù)增加均逐漸降低，而其 NPQ 則持續(xù)增加。在相同光照時(shí)間內(nèi)，與正常轉(zhuǎn)綠的葉片(CK)相比，各濃度Pb或者PEG脅迫黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉片F(xiàn)v/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP數(shù)值均顯著下降，但NPQ數(shù)值同時(shí)顯著增加，且脅迫濃度越高各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的升降幅度越大。其中，在光照72h后，0．3、0．6、1mmol/L的Pb(NO3)2 溶液處理菜豆幼 苗 葉 片 Fv/Fm 分 別 比 對(duì) 照 (CK)顯 著 降 低27．3%、35．79% 和 36．4%，F(xiàn)v′/Fm′分 別降低12．43%、16．13%和24．7%，Y(Ⅱ)分別降低27．71%、34．47%和44．8%，qP分別降低25．13%、31．57%和39．86%，而NPQ分別顯著增加222%、283%和413%(P<0．05)；同時(shí)，在光照72h后，5%、10%、15%的PEG脅迫菜豆葉片的Fv/Fm分別比對(duì)照(CK)顯著降低31．48%、39．61%和48．09%，F(xiàn)v′/Fm′分別顯著降低46．29%、50．39%和55．42%，Y(Ⅱ)分別顯著降低54．82%、45．78%和74．31%，qP分別顯著降低38．20%、60．28%、67．94%，但NPQ分別顯著增加257%、395．7%和514%(P<0．05)。以上結(jié)果說明Pb或PEG脅迫會(huì)引起菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中PSⅡ開放程度的降低，對(duì)電子的接受、傳遞能力下降，抑制 PSⅡ?qū)饽艿奈找约斑\(yùn)行效率，使得更多的光能無法被利用，而是以熱的形式耗散掉，即 Pb或 PEG 脅迫顯著降低了 PSⅡ?qū)饽艿睦寐省?/p>
同期不同小寫字母表示處理之間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)；以下圖表同。圖1 不同濃度Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素含量的變化Different lower cases with the same time indicate significant differences between treatments at 0.05 level (P<0.05); the same as below table and figuresFig.1 The change of chlorophyll content in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2 (A)or PEG(B) stress
表1 Pb(NO3)2脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
注：Fv/Fm. PSⅡ潛在最大光化學(xué)量子效率;Fv′/Fm′.光適應(yīng)下最大光化學(xué)效率; Y(Ⅱ).PSⅡ光適應(yīng)下實(shí)際光化學(xué)效率;qP.光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)；NPQ.非光化學(xué)猝滅系數(shù)；下同
Note:Fv/Fm. The potential maximal photochemical efficiency of PSⅡ;Fv′/Fm′. The maximum quantum efficiency of PSⅡ photochemistry at illumination; Y(Ⅱ). Effective photochemical quantum yield of PSⅡphotochemistry at illumination;qP. Photochemical quenching coefficient; NPQ. Non-photochemical quenching; The same as below
表2 PEG脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
2.3 Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中交替呼吸途徑容量的影響
由圖2可看出，在經(jīng)歷24、72 h光照后，各處理黃化的菜豆幼苗葉片交替呼吸途徑容量均比照光前(0 h)大幅上升，且光照時(shí)間越長增幅越大。在相同光照時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)綠過程中菜豆黃化幼苗葉片交替呼吸途徑容量隨著Pb(NO3)2濃度的升高而逐漸增加，而隨著PEG脅迫濃度的增加而先上升后降低，并在10%PEG脅迫下達(dá)到最大值，且各濃度Pb或者PEG脅迫處理均顯著高于同期對(duì)照(CK)。其中，經(jīng)72 h光照后，菜豆黃化幼苗葉片抗氰呼吸途徑容量在0.3、0.6、1 mmol/L的Pb(NO3)2脅迫處理下分別比對(duì)照顯著增加632.8%、816.6%、1 065%、1 129.6%，在5%、10%、15% PEG脅迫下分別顯著上升479.9%、555%、629.6%、374.8%。以上結(jié)果說明不同濃度的Pb或PEG脅迫均顯著增加了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉片交替呼吸途徑容量。
2.4 Pb或PEG脅迫下SHAM對(duì)黃化葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響
為了研究在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑對(duì)菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的影響，我們分別在0.3 mmol/L Pb(NO3)2和5% PEG脅迫下考察了交替呼吸途徑抑制劑SHAM(1 mmol/L)處理葉片在轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量的變化。圖3顯示，在菜豆幼苗葉片正常(無脅迫)轉(zhuǎn)綠過程中，單獨(dú)經(jīng)過SHAM處理(1 mmol/L)的葉片葉綠素含量未受到顯著影響。然而，Pb(NO3)2+SHAM處理均使黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量比Pb(NO3)2脅迫處理顯著下降，且降幅隨光照時(shí)間的延長進(jìn)一步加大。相似地，PEG脅迫下，PEG+ SHAM處理也使得黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量比PEG脅迫處理進(jìn)一步顯著下降，并以PEG+ SHAM處理降幅更大，且下降幅度隨光照時(shí)間的延長而加劇。另外，隨著脅迫濃度的增大及時(shí)間的延長，PEG脅迫下交替呼吸途徑對(duì)黃化菜豆葉片葉綠素含量的影響程度顯著高于相應(yīng)Pb脅迫。以上結(jié)果說明Pb(NO3)2或PEG脅迫下交替呼吸途徑受到的抑制導(dǎo)致了黃化菜豆幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量進(jìn)一步下降，因此交替呼吸途徑在植物細(xì)胞內(nèi)很有可能是通過調(diào)節(jié)葉綠素的含量來促進(jìn)植物在環(huán)境脅迫下維持PSⅡ正常運(yùn)行。
2.5 Pb或PEG脅迫下SHAM對(duì)菜豆黃化幼苗葉片轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由表3、4可知，菜豆黃化幼苗正常轉(zhuǎn)綠過程中，單獨(dú)1 mmol/L SHAM處理均沒有使得葉片各葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生顯著變化；在Pb或者PEG脅迫下，SHAM處理使得黃化菜豆葉片轉(zhuǎn)綠過程中Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)和qP均比相應(yīng)的Pb或者PEG脅迫處理顯著下降，而同期卻均NPQ則顯著上升，且各參數(shù)的升降幅度隨著光照時(shí)間的延長而加大。以上結(jié)果說明抑制交替呼吸途徑會(huì)加劇Pb或PEG脅迫對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心活性的進(jìn)一步抑制，還原力的積累加劇，造成熱耗散進(jìn)一步增加，這可能暗示在脅迫條件下交替呼吸途徑是有助于緩解PSⅡ的過度還原，幫助維持其正常運(yùn)行。
圖2 Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片交替呼吸途徑容量的變化Fig.2 The capacity of alternative respiratory pathways in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2 (A)or PEG(B) stress
圖3 Pb(NO3)2(A)或PEG(B)脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素含量的影響Fig.3 The effects of SHAM treatment on chlorophyll content in greening leaves of bean seedlings under Pb(NO3)2(A) or PEG(B) stress
表3 Pb(NO3)2脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
表4 PEG脅迫下SHAM處理對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中菜豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
3 討 論
許多研究表明，環(huán)境脅迫會(huì)影響正常生長的植物葉綠素的合成和光化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行[18-21]。同時(shí)，在環(huán)境脅迫下， PSⅡ比PSⅠ更易受到環(huán)境脅迫的損傷，其運(yùn)行水平的下降是植物光化學(xué)反應(yīng)能力在環(huán)境脅迫下降低的主要原因[22-23]。本研究顯示，較之正常轉(zhuǎn)綠的菜豆黃化幼苗，Pb或PEG脅迫導(dǎo)致黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量、Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)明顯下降，同時(shí)NPQ顯著增加。這一觀察結(jié)果表明，黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中，Pb或PEG脅迫阻礙了葉綠素的合成，降低了PSⅡ的容量和運(yùn)行水平。以前的研究發(fā)現(xiàn)，光合電子傳遞鏈中原初電子受體還原性的增加會(huì)阻礙光合電子傳遞鏈相關(guān)蛋白以及葉綠素合成酶等重要蛋白質(zhì)向質(zhì)體的輸入[14-15]。qP反映了光合電子傳遞鏈原初電子受體氧化還原狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，Pb或PEG脅迫均導(dǎo)致了黃化幼苗在轉(zhuǎn)綠過程中qP明顯下降，表明Pb或PEG脅迫增加了轉(zhuǎn)綠過程中光合電子傳遞鏈原初電子受體的還原性。因此，Pb或PEG脅迫導(dǎo)致的轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素合成受阻以及PSⅡ容量和運(yùn)行水平的下降可能均與光合電子傳遞鏈中原初電子受體還原性的增加有關(guān)。
同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)，在菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程中，交替呼吸途徑的容量隨著光照時(shí)間而不斷上升，而Pb(NO3)2或PEG脅迫使得交替呼吸途徑的容量進(jìn)一步增加。為了進(jìn)一步查明在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑與轉(zhuǎn)綠過程的關(guān)系，我們比較了在Pb或PEG脅迫下交替呼吸途徑的抑制劑SHAM對(duì)轉(zhuǎn)綠過程中幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)水平的影響。本實(shí)驗(yàn)室之前工作顯示，對(duì)菜豆葉片噴灑1 mmol/L的SHAM可有效抑制其交替呼吸途徑的水平[24-25]。在無脅迫條件下，對(duì)菜豆黃化幼苗葉片施加1 mmol/L SHAM并未引起黃化幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)水平的顯著性變化；而在Pb或PEG脅迫下，對(duì)菜豆黃化幼苗葉片施加1 mmol/L SHAM導(dǎo)致了其葉綠素含量、Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)和qP的進(jìn)一步下降和NPQ的進(jìn)一步增加。表明在Pb或PEG脅迫下，抑制交替呼吸途徑會(huì)加劇Pb或PEG脅迫對(duì)菜豆葉綠素合成的抑制，并導(dǎo)致了PSⅡ的容量和運(yùn)行水平的進(jìn)一步下降和PSⅡ反應(yīng)中心非還原性QB相對(duì)比例的進(jìn)一步增加。有研究發(fā)現(xiàn)，植物能夠通過蘋果酸穿梭途徑以及光呼吸途徑將葉綠體中過多的還原性物質(zhì)(如NADPH)轉(zhuǎn)移至線粒體中，并通過交替呼吸途徑將這些還原性物質(zhì)消耗掉，從而有效阻止了質(zhì)體中過多還原性物質(zhì)的積累，降低了光合電子傳遞鏈的還原性[26-27]。據(jù)此我們推測(cè)，當(dāng)Pb或PEG脅迫阻礙了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程時(shí)，交替呼吸途徑水平的增加能夠通過緩解光合電子傳遞鏈的過度還原而使得葉綠素合成酶等重要蛋白質(zhì)向質(zhì)體的輸入維持在一定的水平，從而緩解了Pb或PEG脅迫對(duì)幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的阻礙作用。但具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究。綜上，Pb或PEG脅迫阻礙了菜豆黃化幼苗轉(zhuǎn)綠進(jìn)程，而交替呼吸途徑可在一定程度上緩解Pb或PEG脅迫對(duì)轉(zhuǎn)綠進(jìn)程的不良影響。
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