李 坤，王永章，屈海泳

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山東青島 266109)

開花植物受精過程中，花粉在柱頭萌發(fā)并伴隨花粉管的生長將花粉管內(nèi)部的精子注入雌蕊的胚中從而完成受精[1]?；ǚ勖劝l(fā)以及生長過程中都離不開Ca2+參與，關(guān)于Ca2+對(duì)花粉管生長重要性的研究自20世紀(jì)60年代就已經(jīng)有報(bào)道，其不僅與花粉的萌發(fā)、花粉管的伸長緊密相關(guān)，而且還通過細(xì)胞內(nèi)外復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)參與花粉與柱頭間的信號(hào)識(shí)別及受精過程[2-4]。有研究表明，體外培養(yǎng)3種相思花粉(Acaciaauriculiformis,Acaciamangium和Acaciacrassicarpa) 時(shí)，Ca2+的濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致花粉管生長出現(xiàn)畸形，花粉管的正常生長需要Ca2+濃度維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鶾5]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，在花粉管尖端部位由Ca2+內(nèi)流所形成的從尖端到基部的Ca2+濃度梯度是花粉管正常生長所必須[6]。同時(shí)，Ca2+會(huì)在花粉管尖端聚集，與質(zhì)子及其他離子維持動(dòng)態(tài)平衡，為花粉管正常的極化生長提供基礎(chǔ)[7]?；ǚ酃苤行纬傻腃a2+濃度梯度不僅可以保證花粉管在花柱中極性生長并成功到達(dá)胚，同時(shí)還支配著尖端離子流動(dòng)、囊泡運(yùn)輸以及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，確?；ǚ酃芗舛诉m度的極性生長來正確定位到雌蕊的胚，及時(shí)釋放出精子細(xì)胞[8-9]。

植物細(xì)胞中游離的Ca2+及其結(jié)合的蛋白質(zhì)是植物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)重要的組成者和參與者，植物細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度易受環(huán)境刺激而發(fā)生變化，并影響細(xì)胞的發(fā)育和生長[10-11]。在植物受刺激的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度很容易發(fā)生短暫的變化，而且花粉管尖端伸長過程中，也需要胞外Ca2+內(nèi)流維持尖端的Ca2+梯度，但目前關(guān)于Ca2+流動(dòng)機(jī)制尚不甚清楚，需要探索一個(gè)穩(wěn)定有效的監(jiān)測方法來監(jiān)測花粉管生長過程中Ca2+動(dòng)態(tài)變化。因此探究一種可以用來準(zhǔn)確反映植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的試驗(yàn)方法就顯得尤為重要，這有助于進(jìn)一步揭示Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的功能及其流動(dòng)機(jī)制[12]。

Ca2+的熒光成像技術(shù)是用來研究細(xì)胞內(nèi)Ca2+作用的一種比較直觀有效的方法。目前植物細(xì)胞中的Ca2+熒光成像方法主要有兩種：一種是以基因編碼的綠色熒光蛋白為Ca2+指示劑成像方法，但此種方法需進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化且耗時(shí)太長；另一種是使用具有熒光的有機(jī)小分子探針[8, 13-14]。常采用的小分子探針是Fluo-3、Fluo-4等，將這些小分子探針與乙酰甲酯結(jié)合易于透過動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜。但在植物細(xì)胞中，這些小分子探針易與活細(xì)胞細(xì)胞壁中含有的酯酶發(fā)生酶解作用而使探針不易透過細(xì)胞膜，因此有大量研究關(guān)于熒光試劑如何透過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與鈣結(jié)合產(chǎn)生熒光[15]。Ca2+熒光成像的效果很大程度上依賴于探針加載的方法，為促進(jìn)這些小分子探針進(jìn)入植物細(xì)胞，一種方法是通過顯微注射的方法直接將探針注入細(xì)胞內(nèi)，但這種方法對(duì)設(shè)備儀器和研究人員的熟練程度的要求比較高，不利于廣泛使用。另一種常用的方法是低溫加載法，可避免細(xì)胞中酯酶的酶解作用，但耗費(fèi)時(shí)間偏長，一般需要過夜等[16-17]。目前用于檢測花粉管細(xì)胞內(nèi)Ca2+的探針或方法，在探針透過花粉細(xì)胞壁結(jié)合胞內(nèi)Ca2+時(shí)大部分對(duì)花粉粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成傷害，使花粉活性降低[6, 12]。

目前有許多與負(fù)壓滲透相關(guān)的報(bào)道，如通過負(fù)壓輔助的方法促進(jìn)基因載體滲透進(jìn)入細(xì)胞，可以在無植物組織培養(yǎng)和再生的情況下獲得基因轉(zhuǎn)化株[18-19]。也有報(bào)道成功使用負(fù)壓轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行不同種類植物的基因轉(zhuǎn)化[20-22]。在負(fù)壓條件下，細(xì)菌可以滲透進(jìn)入到植物的部分器官進(jìn)行轉(zhuǎn)化，顯著提高基因轉(zhuǎn)化效率[23]。受此啟發(fā)，本文探索在不影響花粉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活性的情況下，采用負(fù)壓滲透的方法改變加載的物理?xiàng)l件來促進(jìn)熒光探針進(jìn)入花粉細(xì)胞，檢測花粉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料的收集及培養(yǎng)

本試驗(yàn)以豐水梨(PyruspyrifoliaNakai. cv. Hosui)的花粉為實(shí)驗(yàn)材料，在山東省果樹研究所的試驗(yàn)果園收集，將開花前一天或當(dāng)天即將開花的梨樹花蕾取下，待花藥自然散開后收集花粉，干燥后儲(chǔ)存于-20 ℃條件下備用?；ǚ叟囵B(yǎng)參考屈海泳等的方法[24]，花粉培養(yǎng)液中含有成分為1 mmol/L KNO3、0.55 mmol/L Ca(NO3)2、1.6 mmol/L H3BO3、1.6 mmol/L MgSO4和440 mmol/L蔗糖， pH值為6.0～6.2。

1.2 細(xì)胞內(nèi)鈣檢測

Ca2+濃度檢測采用熒光探針Fluo-4/AM(Dojindo Laboratories，日本)進(jìn)行。Fluo-4/AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，F(xiàn)luo-4/AM自身不具熒光，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)可以穿透細(xì)胞膜，AM進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被胞內(nèi)酯酶水解，產(chǎn)生的Fluo-4具有足夠敏感性，與Ca2+結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度會(huì)增加100倍，可以用來監(jiān)測報(bào)告細(xì)胞內(nèi)游離的低濃度Ca2+[25]。

1.3 花粉管負(fù)壓下加載熒光染料的方法

將50 μg的Fluo-4/AM溶解在91.2 μL的無水二甲基亞砜中，于-20 ℃條件下避光密封保存，得到Fluo-4/AM母液；將-20 ℃條件下密閉保存的花粉于常溫放置2 h，與培養(yǎng)液混勻至最終濃度為1×105～1×107?；ǚ?mL，于25 ℃條件下分別培養(yǎng)0.5 h和2 h，得到花粉粒懸浮液和花粉管懸浮液。

1.3.1花粉管負(fù)壓加載熒光探針分別取2 μL的Fluo-4/AM母液和98 μL培養(yǎng)2 h的花粉管懸浮液放置于0.2 mL微量離心管中，混勻。然后將加入Fluo-4/AM母液和花粉懸浮液的離心管打開蓋子分別置于4 ℃和25 ℃的真空干燥箱中，在負(fù)壓條件下(-80 kPa)避光培養(yǎng)0.5～2 h，然后打開裝置恢復(fù)到常壓。對(duì)照為常壓下不同溫度的培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的離心管進(jìn)行離心，10 000 r·min-1離心1 min，棄去上清，用不含F(xiàn)luo-4/AM的培養(yǎng)液洗滌3次。

1.3.2花粉粒負(fù)壓加載熒光探針另取2只0.2 mL微量離心管加入98 μL培養(yǎng)0.5 h的花粉粒懸浮液，分別加入2 μL的Fluo-4/AM母液和2 μL花粉培養(yǎng)液，重復(fù)上述1.3.1的過程。對(duì)照加入100 μmol/L Fluo-4/AM在常壓(4 ℃)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間。

1.3.3顯微鏡觀察使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，德國)觀察花粉管染色情況。檢測時(shí)使用的激發(fā)波長為488 nm左右，發(fā)射波長為500～550 nm。

1.4 花粉萌發(fā)及花粉管活性的檢測

在離心管中加入花粉和培養(yǎng)液后放置在負(fù)壓(4 ℃)條件下處理2 h，之后放置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。對(duì)照不進(jìn)行負(fù)壓處理直接置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在低倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野(重復(fù))統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)10個(gè)花粉。

使用紅墨水進(jìn)行染色，參考劉葦?shù)鹊姆椒╗26]，略有修改。具體操作：將負(fù)壓條件下處理的花粉置于10% 的紅墨水中，室溫放置10 min，顯微鏡下進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。根據(jù)花粉細(xì)胞質(zhì)膜的選擇透過性和對(duì)探針選擇吸收的能力來判斷花粉的活性，喪失活性的花粉易被染色，而活力較強(qiáng)的正?；ǚ鄄荒鼙蝗旧?。

1.5 Cd2+、La3+和EGTA對(duì)熒光的影響

Cd2+、La3+常被用作Ca2+通道抑制劑來觀察植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化[27]。在Fluo-4/AM加載完成后，分別在懸浮液中添加終濃度為10、100、1 000 μmol/L的 Cd2+和La3+，室溫放置15 min進(jìn)行觀察。另外，在Fluo-4/AM加載完成的懸浮液中加入終濃度為10、100、1 000 μmol/L的Ca2+螯合劑EGTA(C14H24N2O10)，室溫放置15 min進(jìn)行觀察。以正常培養(yǎng)負(fù)壓加載Fluo-4/AM后的花粉作為對(duì)照。

1.6 圖像分析

熒光圖像使用軟件Image-Pro Plus software和Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Mountain View, CA)進(jìn)行分析處理，方法參考屈海泳等[24]。數(shù)據(jù)分析使用軟件Microsoft Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)壓滲透處理后對(duì)花粉活性及花粉粒加載Fluo-4/AM的影響

為驗(yàn)證負(fù)壓是否會(huì)影響花粉萌發(fā)，將花粉懸浮液先在負(fù)壓條件下培養(yǎng)2 h，發(fā)現(xiàn)花粉可以正常萌發(fā)(圖1，A、B)，對(duì)花粉萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果負(fù)壓條件下的萌發(fā)率為15.7%，與正常萌發(fā)的萌發(fā)率(對(duì)照)16.0%相比無顯著差異(圖1，E)。為驗(yàn)證負(fù)壓是否會(huì)對(duì)已萌發(fā)的花粉管的活性產(chǎn)生影響，將負(fù)壓條件下培養(yǎng)2 h的花粉使用紅墨水進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，在負(fù)壓條件下培養(yǎng)2 h的花粉管與沒有負(fù)壓培養(yǎng)的花粉管相同，都沒有被染成紅色(圖1，C、D)，表明負(fù)壓處理2 h對(duì)花粉的萌發(fā)及花粉管生長并無影響。

加入Fluo-4/AM之后的花粉懸浮液，在負(fù)壓(4 ℃)條件下培養(yǎng)30 min，然后恢復(fù)常壓。在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，花粉粒在經(jīng)負(fù)壓處理后，含有Fluo-4/AM的懸浮液中有比較明亮的熒光(圖2，A)，而常壓處理和不含F(xiàn)luo-4/AM的懸浮液中的花粉粒熒光非常微弱(圖2，B、C)，這表明負(fù)壓條件能促進(jìn)探針Fluo-4/AM進(jìn)入花粉粒。

A．對(duì)照，正常培養(yǎng)2 h的花粉生長狀況；B．負(fù)壓處理2 h后培養(yǎng)2 h的花粉生長狀況；C．花粉正常培養(yǎng)2 h后，負(fù)壓處理2 h后用紅墨水染色；D．花粉正常培養(yǎng)2 h后，用紅墨水染色,不進(jìn)行負(fù)壓處理；E．花粉萌發(fā)率(每組3次重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)10個(gè)花粉，標(biāo)尺=50 μm，P < 0.05)圖1 負(fù)壓滲透對(duì)花粉活性的影響A. Control, the pollens growing in normal culture for 2 h; B. The pollens were cultured for 2 h after vacuum infiltration treatment for 2 h; C. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink after vacuum infiltration treatment for 2 h; D. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink without vacuum infiltration treatment. E. Pollen germination rate (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen, bar=50 μm, P < 0.05)Fig.1 Effect of vacuum infiltration on pollen activity

2.2 花粉管負(fù)壓滲透條件及滲透時(shí)間對(duì)Fluo-4/AM加載的影響

為研究花粉管加載Fluo-4/AM時(shí)，最適的負(fù)壓滲透條件，將培養(yǎng)后的花粉進(jìn)行了不同時(shí)間和不同條件下的加載處理。在加入Fluo-4/AM之前花粉管不含熒光(圖3，A、B)；培養(yǎng)2 h的花粉加入Fluo-4/AM負(fù)壓處理15 min后，花粉管尖端部分含有微弱熒光信號(hào)(圖3，C、D)；在加入Fluo-4/AM負(fù)壓處理30 min后，花粉管從基部到尖端出現(xiàn)比較明顯的熒光信號(hào)和梯度變化，而且在尖端區(qū)域更加明顯(圖3，E、F)；在負(fù)壓中處理1 h后，整個(gè)花粉管充滿熒光，花粉管Ca2+梯度消失(圖3，G、H)。表明在負(fù)壓處理30 min后可以促進(jìn)Fluo-4/AM進(jìn)入花粉管中，若延長處理時(shí)間，則會(huì)導(dǎo)致花粉管Ca2+梯度消失。

A.加入Fluo-4/AM后負(fù)壓滲透處理的花粉粒；B.沒有添加Fluo-4/AM的花粉粒(對(duì)照)；C.添加Fluo-4/AM常壓條件放置的花粉粒圖2 負(fù)壓滲透對(duì)花粉粒中Fluo-4/AM加載的影響A. After adding Fluo-4 /AM, the pollen grains were treated by vacuum infiltration; B. Control, the pollen grains without Fluo-4 /AM; C. Under the normal pressure condition after adding Fluo-4/AMFig.2 Effect of vacuum infiltration on Fluo-4 /AM loading in pollen grains

A和B.對(duì)照，沒有添加Fluo-4/AM的花粉管；C和D.負(fù)壓滲透處理15 min；E和F.負(fù)壓滲透處理30 min；G和H.負(fù)壓滲透處理1 h圖3 負(fù)壓滲透時(shí)間對(duì)花粉管中Fluo-4/AM加載的影響A and B. Control, pollen tube without Fluo-4 /AM; C and D. Vacuum infiltration treatment for 15 min; E and F. Vacuum infiltration treatment for 30 min; G and H. Vacuum infiltration treatment for 1 hFig.3 Effect of vacuum infiltration time on Fluo-4 /AM loading in the pollen tube

在正常培養(yǎng)2 h后的花粉管懸浮液中加入Fluo-4/AM，放置于常壓和負(fù)壓及4 ℃和25 ℃的條件下培養(yǎng)30 min發(fā)現(xiàn)，在室溫(25 ℃)條件下，低壓處理后可觀察到部分熒光(圖4，A、B)，而常壓處理的花粉管中含有微弱的熒光(圖4，C、D)，且主要分布在花粉管的邊緣區(qū)域。另外，可以觀察到在低溫(4 ℃)條件下，經(jīng)過低壓處理的花粉管具有明亮的熒光，從尖端到基部的熒光密度存在由高到低的梯度變化(圖4，E、F)，而常壓條件下的花粉管雖然可觀察到有熒光，但熒光較弱且無梯度變化(圖4，G、H)。說明低壓有助于探針透過花粉管質(zhì)膜進(jìn)入花粉管與Ca2+結(jié)合。低壓情況下低溫的熒光明顯高于室溫條件下，也表明低溫對(duì)探針進(jìn)入質(zhì)膜同樣有促進(jìn)作用。

2.3 花粉管負(fù)壓滲透處理加載Fluo-4/AM與F-127輔助加載比較

Pluronic F-127 (F-127)是一種較常用的可提高細(xì)胞滲透性的活性劑，常用來協(xié)助熒光探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[25]。取0.1 mL培養(yǎng)2 h的花粉懸浮液加入100 μmol/L Fluo-4/AM和0.2% F-127，在4 ℃條件下進(jìn)行輔助加載2 h。與負(fù)壓輔助加載相比，2種方法都能很好地反映花粉管中的Ca2+濃度梯度(圖5，A～D)，加入F-127的花粉管尖端區(qū)域的熒光密度低于負(fù)壓條件下加載的花粉管尖端的熒光密度，但差異不顯著(圖5，E)。說明負(fù)壓條件下加載可以促進(jìn)Fluo-4/AM進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合Ca2+，相較于使用F-127加載2 h，負(fù)壓加載可以明顯縮短加載時(shí)間。

2.4 La3+、Cd2+和EGTA處理后花粉管Ca2+梯度的變化

Cd2+和La3+處理可以抑制Ca2+離子通道。使用不同濃度的La3+對(duì)負(fù)壓加載Fluo-4/AM的花粉管進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在10 μmol/L的La3+處理時(shí)花粉管尖端Ca2+熒光密度顯著降低，花粉管尖端的Ca2+梯度被破壞(圖6，A～D、K)。另外，10 μmol/L的Cd2+處理時(shí)花粉管尖端到基部仍存在Ca2+濃度從高到低的梯度變化，但花粉管尖端所含的熒光密度明顯降低(圖6，A、B、E、F、L)，100 μmol/L、1 000 μmol/L的Cd2+處理后花粉管尖端的Ca2+梯度變化被破壞(圖6，G、H、I、J)。

在使用10 μmol/L的Ca2+螯合劑EGTA處理時(shí)，對(duì)花粉管尖端的熒光密度并無顯著變化，但對(duì)花粉管尖端Ca2+梯度產(chǎn)生影響，而100 μmol/L、1 000 μmol/L的EGTA處理時(shí)，花粉管尖端的熒光密度相較于10 μmol/L的EGTA處理出現(xiàn)了明顯下降(圖7)，說明細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，這可能是由于EGTA螯合胞外Ca2+，導(dǎo)致花粉管細(xì)胞外部Ca2+濃度降低，減少了Ca2+向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。

3 討 論

花粉管的正常生長需要細(xì)胞內(nèi)外Ca2+共同參與，胞內(nèi)外Ca2+濃度變化對(duì)花粉管生長具有重要調(diào)節(jié)作用[28]。Ca2+熒光探針和Ca2+成像是研究細(xì)胞中Ca2+動(dòng)態(tài)變化的重要方法，然而由于植物細(xì)胞細(xì)胞壁的存在使得大多數(shù)探針難以穿過活細(xì)胞的細(xì)胞壁，進(jìn)入后又易在液泡聚集，不能準(zhǔn)確地反映活細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的信息[29]。

目前植物細(xì)胞Ca2+成像最成功和廣泛使用的技術(shù)是顯微注射技術(shù)，將熒光探針直接微注射到植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但這種方法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，而且操作過程非常繁瑣和耗時(shí)[30]。另外，使用顯微注射技術(shù)對(duì)植物原生質(zhì)體中的Ca2+加載時(shí)，由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁和極性，它們的反應(yīng)可能并不能準(zhǔn)確反映其生理機(jī)制[31]。雖然目前存在許多熒光探針與具有細(xì)胞滲透性的乙酰甲酯結(jié)合可以透過細(xì)胞壁，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的使用可以檢測不同刺激下植物細(xì)胞中Ca2+的空間分布變化，但是這種探針又必須在低溫條件下進(jìn)行，以此來避免細(xì)胞中酯酶對(duì)探針的酶解作用，因此導(dǎo)致這一類熒光探針加載時(shí)間較長，試驗(yàn)效率較低[24]。本研究中，負(fù)壓滲透不影響花粉正常萌發(fā)生長，而且可以促進(jìn)了熒光探針跨過花粉細(xì)胞壁進(jìn)入花粉管，并沒有破壞花粉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性，但隨著負(fù)壓滲透時(shí)間的延長可能會(huì)對(duì)花粉管存在傷害。有研究表明，在使用Fluo-4/AM加載細(xì)胞質(zhì)中Ca2+時(shí)，隨著加載時(shí)間的延長，F(xiàn)luo-4/AM會(huì)受細(xì)胞內(nèi)區(qū)室化的影響在細(xì)胞器內(nèi)聚集，但這種情況可以通過低溫條件下、縮短加載時(shí)間來避免[32]。本研究采用低溫條件下負(fù)壓滲透的方法，可以降低植物細(xì)胞壁中的酯酶對(duì)AM的酶解作用使Fluo-4/AM容易透過細(xì)胞壁加載到植物細(xì)胞中，避免熒光探針進(jìn)入細(xì)胞時(shí)被水解及進(jìn)入細(xì)胞后區(qū)室化的影響[33]。另外，在負(fù)壓條件下，介質(zhì)中各物質(zhì)分子發(fā)生失重而四處飄游,增加了各分子間接觸和碰撞的機(jī)會(huì)，使分子間的結(jié)合變得更加容易[34]。在此條件下熒光探針更容易和花粉管中的Ca2+結(jié)合使反應(yīng)加速完成進(jìn)一步提高染色的效率，但是需控制負(fù)壓處理的時(shí)間，時(shí)間過長會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大影響。

A和B.低壓室溫條件下處理30 min；C和D.常壓室溫條件下處理30 min；E和F.低壓低溫條件下處理30 min；G和H.低壓室溫條件下處理30 min圖4 壓強(qiáng)和溫度對(duì)Fluo-4/AM加載的影響A and B. Under low pressure room temperature for 30 min; C and D. Normal pressure at room temperature for 30 min; E and F. Under low temperature and low pressure condition for 30 min; G and H. Under low pressure room temperature for 30 minFig.4 The effect of pressure and temperature on Fluo-4 /AM loading

A和B.負(fù)壓滲透處理30 min；C和D.F-127處理2 h；E.負(fù)壓滲透和F-127處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計(jì)分析 (每組3次重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)10個(gè)花粉管，P < 0.05)圖5 F-127處理對(duì)花粉管中Ca2+濃度的影響A and B. Vacuum infiltration treatment for 30 min; C and D. F-127 treatment for 2 h; E. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube after the vacuum infiltration and F-127 treatment (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.5 Effects of F-127 treatment on Ca2+ concentration in pollen tubes

A和B.對(duì)照，負(fù)壓下加載染料的花粉管；C和D.10 μmol/L的La3+處理；E和F.10 μmol/L的Cd2+處理；G和H.100 μmol/L的Cd2+處理；I和J.1 000 μmol/L的Cd2+處理；K.不同濃度La3+處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計(jì)分析；L.不同濃度Cd2+處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計(jì)分析(每組3次重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)10個(gè)花粉管，P < 0.05)圖6 La3+、Cd2+對(duì)花粉管中Ca2+濃度的影響A. and B. Control, pollen tubes loaded with dye under vacuum; C and D. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L La3+; E and F. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L Cd2+; G and H. The pollen tubes were treated with 100 μmol/L Cd2+; I and J. The pollen tubes were treated with 1 000 μmol/L Cd2+; K. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration La3+ treatments; L. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration Cd2+ treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.6 Influence of different concentrations of La3+ and Cd2+ on Ca2+ concentration in pollen tube

花粉管負(fù)壓滲透加載Fluo-4/AM后不同濃度EGTA處理:A和B.對(duì)照，不含EGTA；C和D.10 μmol/L EGTA；E和F.100 μmol/L EGTA；G和H.1 000 μmol/L EGTA；I.不同濃度EGTA處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計(jì)分析(每組3次重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)10個(gè)花粉管，P<0.05)圖7 不同濃度EGTA對(duì)花粉管中Ca2+濃度的影響After vacuum infiltration loading Fluo-4 /AM, the pollen tubes were treated with different concentrations of EGTA: A and B. Control, without EGTA; C and D. 10 μmol/L EGTA; E and F. 100 μmol/L EGTA; G and H. 1 000 μmol/L EGTA; I. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration EGTA treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P<0.05)Fig.7 Influence of different concentrations of EGTA on Ca2+ concentration in pollen tube

雖然F-127常用來促進(jìn)乙酸甲酯(AM)類Ca2+熒光探針進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)水解結(jié)合Ca2+[25]。但是在神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+的調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-127顯著地改變了神經(jīng)元細(xì)去極化所誘發(fā)的Ca2+瞬變[35]。其次，由于F-127影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性，在平滑肌單細(xì)胞加載時(shí)使用F-127，會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)中水解的探針釋放出細(xì)胞，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，所以F-127不適合用于單細(xì)胞中的Ca2+熒光成像[24, 36]。本研究結(jié)果表明，負(fù)壓輔助加載效果與F-127輔助加載的效果并無明顯差異，使用此種方法也可避免使用F-127所造成的不足。

Ca2+通道抑制劑La3+可以與Ca2+競爭抑制大量Ca2+通道，使細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+減少，另外其還可以抑制植物細(xì)胞質(zhì)膜上Ca2+滲透通道來抑制Ca2+流入[37]。在La3+的影響下，花粉管生長、Ca2+通道滲透性、細(xì)胞內(nèi)Ca2+梯度和細(xì)胞外Ca2+濃度都會(huì)受到顯著影響[38]。因此，La3+常用來影響花粉萌發(fā)和花粉管正常生長。在La3+離子存在的情況下，花粉管的熒光密度和Ca2+濃度梯度都發(fā)生了顯著變化。其次，有研究認(rèn)為高濃度的Cd2+會(huì)抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長[39]。Cd2+的存在減少了細(xì)胞壁可塑性和可擴(kuò)展性，并損害花粉管正常的細(xì)胞伸長，導(dǎo)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變。同時(shí)，Cd2+的存在抑制了花粉管尖端Ca2+的流入，導(dǎo)致尖端Ca2+梯度紊亂、花粉管熒光強(qiáng)度降低，這與文中Cd2+的處理結(jié)果相一致[24, 40-41]。另外，花粉生長時(shí)，細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)可以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)游離Ca2+濃度增加，維持花粉管極性生長所需的濃度梯度[42]。在EGTA處理后，EGTA可以螯合花粉管外部Ca2+，影響花粉管的正常生長，這種細(xì)胞外Ca2+在花粉管生長中的作用機(jī)制目前仍不清楚，但對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、膜完整性，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響都是有可能的[43-44]。使用抑制劑及螯合劑改變花粉管內(nèi)外Ca2+的濃度，花粉管中熒光密度都出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，也表明此方法具有一定可靠性。

總之，此處理方法不僅具有所需器材也較容易準(zhǔn)備和使用方法易于掌握等優(yōu)點(diǎn)，而且在低溫負(fù)壓條件下加載可以保持花粉活力，促進(jìn)熒光探針通過質(zhì)膜滲透進(jìn)入花粉管，有效縮短探針加載時(shí)間從而避免細(xì)胞內(nèi)區(qū)室化的影響。