文 /李志廣 閉鳳麗 張凌云 劉波 張德明 劉嘉祺 譚美凌

在線固相萃取-三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)快速測(cè)定水中氯霉素（CAP）的方法開發(fā) // 本方法采用Waters OA在線固相萃取裝置，簡(jiǎn)化復(fù)雜的離線固相萃取操作，降低人工成本，提高分析效率，該方法靈敏度高，可移植性好，可滿足氯霉素在水體的痕量快速檢測(cè)。

抗生素面世以來,人們找到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，大衛(wèi)教授于1947年發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生氯霉素的鏈霉菌，1949年氯霉素引入臨床使用。近代，氯霉素因價(jià)格低廉曾大量應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)及水產(chǎn)業(yè)，氯霉素的不完全代謝會(huì)殘留在動(dòng)物肉制品及水產(chǎn)品中，人類食用含有氯霉素的動(dòng)物制品時(shí)，可能導(dǎo)致造血障礙等毒副作用。

現(xiàn)代人長(zhǎng)期暴露在抗生素環(huán)境中，人體在食物中積累抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)也有報(bào)道指出抗生素會(huì)對(duì)人體造成毒理損害和三致風(fēng)險(xiǎn)。在國內(nèi)，人們對(duì)抗生素的消耗巨大，大部分抗生素不能被人體完全吸收?？股丶捌浯x產(chǎn)物可通過排泄的方式進(jìn)入到生活污水，在污水處理中抗生素可能會(huì)影響到地下水和環(huán)境地表水，對(duì)水生生物和土壤有潛在風(fēng)險(xiǎn)。有文獻(xiàn)指出在1992年，氯霉素類和頭孢類內(nèi)酰胺類抗生素年用量為18 t，占總抗生素用用量的52.9%。Sacher等人分析了德國巴登維爾茨堡105個(gè)地下水井，抗生素檢出率較高。有人分析了珠江廣州河段中氯霉素的一年中含量在 11-266 ng/L。

目前，抗生素的環(huán)境生態(tài)學(xué)研究較少，在土壤的殘留時(shí)間與其代謝有關(guān),可能在雨水沖刷土壤的情況下對(duì)地下水造成污染。廢水和水環(huán)境中的藥物污染已經(jīng)引起了人們的注意。隨著抗生素廣泛使用，環(huán)境中檢測(cè)到的抗生素種類繁多，其環(huán)境殘留濃度也逐年升高。另外，由于抗生素對(duì)生態(tài)平衡的影響和人體健康潛在威脅的暴露，抗生素的環(huán)境行為倍受人們關(guān)注。人類過量攝取抗生素風(fēng)險(xiǎn)的主要途徑是食物和受抗生素污染的飲用水。抗生素在環(huán)境水體中的含量極低，需對(duì)目標(biāo)化合物富集才能對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。

目前，抗生素檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、荷移分光光度法等。其中液質(zhì)聯(lián)用法因其分離效果好，靈敏度高，在實(shí)際應(yīng)用中使用最多。傳統(tǒng)液質(zhì)連用法前處理使用手工固相萃取進(jìn)行富集，然后用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)。手工固相萃取富集方法繁瑣，耗費(fèi)大量時(shí)間和人力物力，不適用于大批量做樣品和應(yīng)急檢測(cè)等特點(diǎn)。本文采用的是沃特世公司的全自動(dòng)在線前處理-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，系統(tǒng)使用在線固相微萃取系統(tǒng)，僅需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的過0.22μm濾膜處理，利用在線固相萃取技術(shù)，可快速對(duì)樣品進(jìn)行富集，節(jié)省分析時(shí)間。集成化的在線固相處理系統(tǒng)應(yīng)對(duì)抗生素水體污染突發(fā)事件，具有快速出具數(shù)據(jù)，重復(fù)性好，方法可移植性強(qiáng)等特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters Quattro Premier XE）美國；

全自動(dòng)在線固相萃取前處理儀（2777C Sample Manager）美國；

超純水系統(tǒng)（Thermo MicroPure UV）德國；

圖1 全自動(dòng)在線固相萃取儀的工作原理

在線固相萃取柱（Waters Oasis HLB Direct Connect HP（2.1 x 30 mm，20μm））美國；

濾膜（安譜PTFE針式濾器（水系）0.22μm）中國。

全自動(dòng)在線固相萃取儀的工作原理見圖1，四元溶劑泵（QSM）和二元溶劑泵（BSM）分別服務(wù)于樣品萃取富集系統(tǒng)以及液相檢測(cè)系統(tǒng)。分析過程分為樣品萃取富集以及樣品檢測(cè)階段。在樣品萃取富集階段，從2777C進(jìn)樣器進(jìn)樣5 ml樣品，通過四元溶劑泵（QSM）采用2 ml/min水溶液將樣品加載在萃取柱1上，待目標(biāo)化合物全部加載在萃取柱1后，使用B溶劑和C溶劑按一定比例作為淋洗液除雜。清洗除雜后，切換萃取柱A到UPLC系統(tǒng)，通過二元溶劑泵（BSM）采用高有機(jī)相比例，將萃取柱1上吸附的目標(biāo)化合物洗脫到UPLC系統(tǒng)中進(jìn)行樣品檢測(cè)。在萃取柱1的洗脫過程中，萃取柱2在四元溶劑泵（QSM）中進(jìn)行再生，恢復(fù)萃取柱初始條件等待下一次分析。

主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素（CAP）、購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH，所有標(biāo)準(zhǔn)品純度≥ 94.0%。

普通試劑：乙腈、甲醇、甲酸、丙酮均為色譜純。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與儲(chǔ)存：準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，由甲醇溶液稀釋定容為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-4 ℃下密封、避光保存，使用時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。使用時(shí)，取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用純水稀釋至所需濃度。

在線固相萃取條件

目標(biāo)分析物的在線萃取條件詳見表1及表2。

UPLC-MS/MS 條件

質(zhì)譜條件：氯霉素用負(fù)離子模式（ESI-）的毛細(xì)管電壓3.0 kV；萃取電壓3 V；透鏡電壓0.1 V；離子源溫度120℃；脫溶劑溫度450 ℃；輔助氣流速1000 L/h；錐孔N2流速50 L/h；碰撞氣Ar流速0.15 mL/min。目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)詳見表3。

方法優(yōu)化

1.樣品PH

當(dāng)樣品的PH=7時(shí),目標(biāo)化合物的信號(hào)較強(qiáng)。氯霉素在水溶液PH=4.5-7較穩(wěn)定，堿性條件下，氯霉素不穩(wěn)定，易發(fā)生水解。在酸性條件下，可發(fā)生酰胺水解，選擇PH=7作為樣品PH。

表1在線固相萃取條件四元泵設(shè)置

表2 檢測(cè)流動(dòng)相二元泵設(shè)置

表3 目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

表4 目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

2.萃取柱

在富集柱選擇上，當(dāng)使用HLB萃取柱時(shí)，氯霉素的響應(yīng)值明顯高于C18柱。由于兩種目標(biāo)化合物有羥基，帶有一定極性。C18柱為反向萃取柱，對(duì)極性化合物保留較差。HLB柱也為反向萃取柱但因其載體中帶有特殊親水基團(tuán)對(duì)極性化物也有較好的富集效果，吸附效果較傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)SPE（如C18）好，選擇HLB柱作為萃取柱。

3.流動(dòng)相

當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水時(shí)，氯霉素信號(hào)大幅下降。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水時(shí)，氯霉素的信號(hào)增強(qiáng)。酸性條件下不利于氯霉素負(fù)離子電離，氯霉素液相流動(dòng)相條件選擇乙腈-純水。

4.上樣溶液

本在線固相萃取系統(tǒng)把四元泵中A相溶液作為上樣溶液,通過四元泵把樣品富集到HLB小柱。上樣溶液對(duì)富集效果影響較大。當(dāng)使用0.05%甲酸溶液作為上樣溶液時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)值下降，選取100%純水作為上樣溶液。

方法驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用純水將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為 10、20、40、80、160、320 ng/L的系列工作溶液，在最佳試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，以各化合物峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，兩種抗生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限見表4。

從表中可以看出，氯霉素10-320 ng/L濃度范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。目標(biāo)抗生素的方法檢出限為氯霉素：1.63 ng/L，測(cè)定下限為氯霉素：6.52 ng/L，可滿足水環(huán)境中抗生素痕量分析的要求。

方法準(zhǔn)確度與精密度

取空白水樣（純水），加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得10 ng/L的加標(biāo)樣品，全過程分析，平行測(cè)定11份，做精密度測(cè)試，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5。

表5 純水加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=11）

表6 實(shí)際水樣加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=11）

取實(shí)際水樣，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得100 ng/L的加標(biāo)樣品，全過程分析，平行測(cè)定11份，做加標(biāo)回收測(cè)試，各組分回收率表6。

從表中可以看出，空白水樣平均加標(biāo)回收率為94.2%-115.9 %，地表水水樣平均加標(biāo)回收率為88.12%-102.90%，方法的準(zhǔn)確度良好?？瞻准訕?biāo)水樣測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.74%，地表水加標(biāo)水樣測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.34%，方法的精密度良好，滿足水中檢測(cè)要求。

結(jié)論

相對(duì)于傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)，在線固相微萃取技術(shù)前處理簡(jiǎn)單，僅需將20 ml水樣過0.22μm濾膜，每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間為11分鐘，能節(jié)省大量前處理時(shí)間和人力成本。傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)因上樣時(shí)間，洗

脫速度等條件不易控制，實(shí)驗(yàn)誤差與人操作關(guān)系較大。在線固相微萃取技術(shù)能減少人為誤差，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。本文方法使用MRM模式進(jìn)行定量，CAP的方法檢出限為1.63 ng/L，線性范圍為10-320 ng/L，相關(guān)系數(shù)R=0.9999，實(shí)際水樣回收率為80.69%-102.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.34%，滿足水中痕量分析的要求。