王白鶴 孫建方

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)使上皮細(xì)胞失去極性獲得間充質(zhì)表型，從而具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，它是胚胎發(fā)育所必需的過(guò)程[1]，并且與癌癥進(jìn)展相關(guān)[2]。除了受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)外，EMT還可以在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)控，上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)已被描述為參與EMT相關(guān)的上皮特異性剪接調(diào)節(jié)劑。本篇文章主要針對(duì)ESRPs介導(dǎo)的剪接變體在EMT相關(guān)上皮表型調(diào)節(jié)中的作用和調(diào)控機(jī)制[3]，以及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性作一綜述。

1 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程序

許多細(xì)胞外信號(hào)通路，比如TGFβ，Notch，Wnt，F(xiàn)GF和HGF能夠通過(guò)誘導(dǎo)EMT-TF(Snail，Slug，ZEB1，ZEB2和Twist)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)EMT過(guò)程。這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑與胚胎發(fā)育密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)通常導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的喪失，這是EMT的首要表現(xiàn)之一。 E-鈣黏蛋白的抑制是通過(guò)在編碼CDH1基因的E-鈣黏蛋白的啟動(dòng)子位點(diǎn)的E盒處形成抑制性復(fù)合物來(lái)介導(dǎo)的。E-鈣黏蛋白的喪失，以及緊密連接和黏附連接功能的喪失以及細(xì)胞頂端-基底極性都是EMT的標(biāo)志，并且導(dǎo)致以間充質(zhì)標(biāo)記物的高表達(dá)為特征的細(xì)胞類(lèi)型，例如波形蛋白表達(dá)，細(xì)胞形狀變成紡錘形，以及獲得遷移和侵襲能力[4]。反向程序MET在胚胎發(fā)育過(guò)程中驅(qū)動(dòng)先前間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能導(dǎo)致EMT途徑的下調(diào)，但是關(guān)于抑制EMT或促進(jìn)MET的特定轉(zhuǎn)錄途徑目前研究較少。

EMT程序的失調(diào)與腫瘤發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。絕大多數(shù)致命的人類(lèi)癌癥是源自上皮組織的腫瘤，例如來(lái)源于乳腺、肺、胰腺和結(jié)腸的腫瘤。雖然早期腫瘤保留了許多正常上皮細(xì)胞的特征，但高度侵襲性的腫瘤獲得間充質(zhì)特征，從而可以侵入周?chē)幕|(zhì)[5]。實(shí)際上，在宮頸癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌和乳腺癌的腫瘤侵襲過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)EMT的表達(dá)，包括E-鈣黏蛋白表達(dá)的喪失，波形蛋白表達(dá)的增加和遷移能力的明顯增強(qiáng)。盡管有大量的體內(nèi)研究與異種移植或遺傳小鼠模型支持EMT在腫瘤進(jìn)展中的因果作用，但是EMT對(duì)人類(lèi)癌癥和轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確影響仍然存在爭(zhēng)議，原因是原發(fā)腫瘤樣本的證據(jù)不足[6]。有研究在癌旁組織發(fā)現(xiàn)了E-鈣黏蛋白的低表達(dá)，其他轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞未顯示EMT的跡象。最近發(fā)現(xiàn)，EMT還與干細(xì)胞特性和耐藥性的獲得有關(guān)[2]，這表明EMT在腫瘤發(fā)生中具有重要的選擇性作用。由于胚胎發(fā)育的重要性以及尚未完全闡明的致癌作用，EMT過(guò)程有待進(jìn)一步研究。

2 ESRPs在細(xì)胞上皮表型調(diào)節(jié)中的作用

使用各種生物信息學(xué)工具和功能性交互網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)ESRPs與EMT過(guò)程密切相關(guān)。多種研究顯示在敲除或過(guò)表達(dá)ESRPs細(xì)胞中，受影響的功能途徑存在大的重疊。具體而言，眾多研究的途徑分析一致證明，主要涉及細(xì)胞黏附，細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)三方面，這些都是特征性地區(qū)分上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的途徑[6]。ESRP靶向的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄編碼蛋白具有上皮細(xì)胞功能，但是還不清楚ESRP誘導(dǎo)的上皮剪接變體是如何調(diào)節(jié)上皮表型的。最近相關(guān)研究進(jìn)展表明，這些上皮剪接變體類(lèi)似于FGFR2，是通過(guò)各種機(jī)制對(duì)上皮細(xì)胞功能發(fā)揮著重要影響。

2.1 影響細(xì)胞黏附的上皮剪接蛋白變體 p120-Catenin：成熟的基于E-鈣黏蛋白的黏附連接點(diǎn)是上皮細(xì)胞的主要標(biāo)志，作為鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物的一部分，p120-連環(huán)蛋白與鈣黏蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且通過(guò)內(nèi)吞作用和蛋白酶體降解來(lái)阻止其下調(diào)，從而作為鈣黏蛋白穩(wěn)定性和功能的主要調(diào)節(jié)劑[7-9]。p120-連環(huán)蛋白的其他功能包括調(diào)節(jié)Rho-GTP酶信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，特別是充當(dāng)了Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)劑[10，11]。編碼p120-連環(huán)蛋白的人CTNND1基因具有四個(gè)不同的翻譯起始位點(diǎn)和四個(gè)可變剪接的外顯子。目前區(qū)分的最相關(guān)的剪接變體是含有替代外顯子2和3的相對(duì)長(zhǎng)的間充質(zhì)特異性剪接變體。間充質(zhì)p120變體的異常表達(dá)與癌癥進(jìn)展有關(guān)，可能是通過(guò)核信號(hào)傳導(dǎo)或通過(guò)影響Rho-GTP酶信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制[10，11]。有研究發(fā)現(xiàn)p120-連環(huán)蛋白的長(zhǎng)間充質(zhì)異構(gòu)體可以促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性，這依賴(lài)于它們抑制RhoA活化的能力[12]。

CD44：CD44蛋白是普遍表達(dá)在跨膜細(xì)胞的表面蛋白。CD44的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域主要作為細(xì)胞外基質(zhì)分子透明質(zhì)酸的受體起作用，并且具有其他ECM組分和細(xì)胞表面受體的其他結(jié)合位點(diǎn)。CD44的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架間接相關(guān)，并介導(dǎo)其信號(hào)功能，從而控制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)黏附，細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和信號(hào)傳導(dǎo)[13]。AS可以產(chǎn)生多種CD44 mRNA轉(zhuǎn)錄物。外顯子1-5和外顯子16-20通常拼接在一起，并編碼標(biāo)準(zhǔn)CD44s蛋白異構(gòu)體。另外包含10個(gè)可變中間體外顯子產(chǎn)生多個(gè)較長(zhǎng)的可變剪接CD44蛋白異構(gòu)體，命名為CD44v1-10[13]。較長(zhǎng)變體形式的CD44具有延伸的細(xì)胞外莖結(jié)構(gòu)域，它具有高度糖基化并提供額外的配體結(jié)合位點(diǎn)[13，14]。包含外顯子變體與癌癥進(jìn)展相關(guān)。雖然包含一些變體外顯子，特別是CD44v4-5和CD44v6增加了轉(zhuǎn)移能力，但是v8-10的包含對(duì)于正常上皮細(xì)胞是典型的并且與E-鈣黏蛋白表達(dá)相關(guān)[14]。CD44v8-10和CD44v1-2取決于ESRP1活性[15]。由于ESRP1的喪失和切換回CD44s表達(dá)而排除這些外顯子對(duì)于EMT發(fā)生是至關(guān)重要的[15]，這表明ESRP部分地通過(guò)抑制CD44抑制EMT過(guò)程。

Integrin-α6：整聯(lián)蛋白是參與細(xì)胞基質(zhì)附著的異二聚體跨膜糖蛋白。目前，已經(jīng)鑒定了18個(gè)α亞基和8個(gè)β亞基，其可以形成異二聚體[16]。層黏連蛋白結(jié)合α6整聯(lián)蛋白亞基與β1整聯(lián)蛋白結(jié)合形成α6β1整合素，它和β4整聯(lián)蛋白在許多細(xì)胞類(lèi)型中被發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)于上皮細(xì)胞，其中α6β4整聯(lián)蛋白是半橋粒的一部分。α6整聯(lián)蛋白基因ITGA6的外顯子25的AS產(chǎn)生兩種剪接變體α6A和α6B。最近，它顯示包含外顯子25，導(dǎo)致α6B的較長(zhǎng)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，由ESRP1介導(dǎo)α6A和α6B剪接變體在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有不同的功能和表達(dá)譜[17]。成人結(jié)腸上皮也顯示差異表達(dá)，因?yàn)棣?B由靜止分化細(xì)胞表達(dá)，而α6A在增殖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[18]。結(jié)腸癌與表達(dá)α6A的細(xì)胞增加相關(guān)，其通過(guò)涉及α6A激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的機(jī)制導(dǎo)致腫瘤增殖增加[18]。尚不清楚它是否促進(jìn)α6整合素向β1轉(zhuǎn)化，比如在乳腺癌干細(xì)胞中，ESRP1介導(dǎo)的α6整合素剪接的喪失可能促進(jìn)α6Aβ1異二聚化并導(dǎo)致腫瘤形成[17]。

2.2 影響轉(zhuǎn)移和侵襲的上皮剪接蛋白變體 MENA：MENA是肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)劑Ena/VASP蛋白家族的成員。它是一種細(xì)胞內(nèi)支架蛋白，調(diào)節(jié)片狀偽足，絲狀偽足,細(xì)胞-細(xì)胞連接和黏著斑中肌動(dòng)蛋白絲的聚合，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞骨架排列和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。與相關(guān)家族成員ENA和VASP相反，目前已經(jīng)在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)了幾種甲型谷胱甘肽的AS異構(gòu)體[19]。除了普遍表達(dá)的人MENA(hMENA)之外，人腫瘤細(xì)胞通常表達(dá)在正常組織中未發(fā)現(xiàn)的一種或多種剪接變體。其中，以跳過(guò)的外顯子6命名的hMENAΔv6與包含外顯子11a變體命名的hMENA11a互斥，hMENA11a的表達(dá)受ESRP1調(diào)節(jié)[20，21]，并與E-鈣黏蛋白表達(dá)和減少的侵襲相關(guān)，與其在上皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)一致，與間充質(zhì)細(xì)胞相反。有趣的是，兩種剪接變體在同一腫瘤中表達(dá)不同，在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)hMENA11a的細(xì)胞構(gòu)成原發(fā)腫瘤的大部分，而侵襲性腫瘤細(xì)胞表達(dá)hMENAΔv6[22]，這些發(fā)現(xiàn)表明，hMENA AS中的ESRP1依賴(lài)性轉(zhuǎn)換控制著腫瘤細(xì)胞的侵襲。實(shí)際上，最近的研究強(qiáng)調(diào)了hMENAΔv6可能用作非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物[19，23]。

Exo70：Exo70是一種八聚體蛋白復(fù)合物，與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的胞吐作用和頂端 - 基底極化有關(guān)。Exo70至少有五種可變剪接的異構(gòu)體[24，25]。在這些異構(gòu)體中，Exo70-E表達(dá)受ESRP1控制并且是上皮特異性的，而Exo70-M存在于缺乏ESRP1的間充質(zhì)細(xì)胞中。這些異構(gòu)體具有不同的功能，僅有Exo80-M結(jié)合Arp2/3復(fù)合物，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。有趣的是，在間充質(zhì)細(xì)胞中引入Exo70-E不僅可以抑制細(xì)胞侵襲，還可以通過(guò)一種可能依賴(lài)于抑制EMT-TF Snail的機(jī)制來(lái)獲得上皮表型[25]。據(jù)報(bào)道，Exo70還可通過(guò)結(jié)合剪接體直接調(diào)節(jié)其自身的剪接，盡管這涉及Exo70-E和Exo-70M之間共有的結(jié)合區(qū)域[24]。然而，這些研究表明由ESRP誘導(dǎo)的Exo70變體可能作為上游潛在的反饋調(diào)節(jié)劑起作用。

3 ESRP剪接變體調(diào)節(jié)EMT過(guò)程

雖然有充足的證據(jù)表明ESRP通過(guò)EMT相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控上皮細(xì)胞的剪接事件，但是ESRP的表達(dá)是EMT過(guò)程的繼發(fā)結(jié)果，還是與EMT相反，是一種相對(duì)獨(dú)立的選擇性轉(zhuǎn)錄后程序，目前尚不清楚?？梢悦鞔_的是，下調(diào)ESRP1和ESRP2是EMT作用的結(jié)果，該過(guò)程由EMT-TFs誘導(dǎo)產(chǎn)生[15，20，26]。

在人乳腺上皮(HMLE)細(xì)胞系中，通過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)Twist ER的表達(dá)，14天內(nèi)完成Twist誘導(dǎo)的EMT過(guò)程，包括E-cadherin的缺失，N-cadherin的獲得，以及成纖維樣細(xì)胞的形成。RNA序列分析發(fā)現(xiàn)Twist-ER誘導(dǎo)HMLE細(xì)胞系中EMT顯著降低ESRP的表達(dá)，并導(dǎo)致大約1500個(gè)AS的改變[15，26]。其中，約8%與外顯子跳躍事件重疊，這些事件在先前研究中歸因于ESRPs[26]。雖然這些結(jié)果可能表明ESRP和EMT控制不同的程序，但是EMT和ESRP調(diào)控AS之間的相互作用還需進(jìn)一步探索。

有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，敲除上皮PNT2細(xì)胞系中ESRP1和ESRP2基因，可以誘導(dǎo)間充質(zhì)標(biāo)志物的形成如波形蛋白，纖連蛋白，MMP-2和N-鈣黏蛋白，并降低E-鈣黏蛋白在質(zhì)膜的定位[21]。有趣的是，MDA-MB-231細(xì)胞中ESRP1和ESRP2的表達(dá)可引起E-鈣黏蛋白升高，而不影響N-cadherin或纖維連接蛋白[27]，表明ESRP可能通過(guò)不同的機(jī)制影響E-鈣黏蛋白的表達(dá)，不同于ESRP誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體對(duì)EMT的上游調(diào)節(jié)。最近有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(HNSCCs)的研究表明，ESRPs可以在EMT中扮演互補(bǔ)角色。ESRP1控制促進(jìn)運(yùn)動(dòng)的Rac1剪接變體Rac1b的AS[28，29]，ESRP2則通過(guò)另外一種不同的機(jī)制下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)。ESRP2降低E-鈣黏蛋白的機(jī)制涉及EMT-TF SIP1，該過(guò)程可下調(diào)E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄[29]。目前對(duì)ESRP2如何調(diào)控SIP1及其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制尚不清楚[29]。

改變細(xì)胞標(biāo)記物如E-鈣黏蛋白的表達(dá)可以誘導(dǎo)EMT程序，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞遷移能力的改變[6]。因此，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ESRP1/ESRP2敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞遷移的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時(shí)敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1，HMEC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，即紡錘形細(xì)胞增加，鵝卵石樣細(xì)胞以及細(xì)胞-細(xì)胞黏附減少。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1可以促進(jìn)細(xì)胞遷移[21]，Ishii等[29]在HNSCCs(SAS和HSC-4)研究中同樣證明了這一點(diǎn)。在HMLE-Twist細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ESRP1后，遷移特征改變?yōu)樵趩螌由掀ぜ?xì)胞中的常見(jiàn)類(lèi)型[26]。在調(diào)查對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的影響時(shí)，觀察到敲除ESRP1可促進(jìn)絲狀偽足的形成，而ESRP2并沒(méi)有。這表明ESRP1和ESRP2是以不同方式抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)：ESRP1通過(guò)細(xì)胞骨架作用，而ESRP2是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞黏附方式。

4 ESRPs和腫瘤形成

在腫瘤形成過(guò)程中，AS和可變蛋白異構(gòu)體一樣，可以促進(jìn)腫瘤癌蛋白的形成。AS被認(rèn)為腫瘤的標(biāo)記物[8，30]，可以影響多個(gè)過(guò)程，包括通過(guò)表達(dá)端粒酶hTERT較短的亞型來(lái)促進(jìn)復(fù)制，通過(guò)EGFR受體的可變剪接促進(jìn)腫瘤的持續(xù)增殖信號(hào)的傳導(dǎo)[31]。AS介導(dǎo)的促癌過(guò)程的其他特征包括逃避生長(zhǎng)抑制因子，減少細(xì)胞凋亡，細(xì)胞代謝失調(diào)和侵襲、轉(zhuǎn)移等[8]。

腫瘤形成與分化上皮的特征缺失有關(guān)，這與ESRPs在腫瘤形成中的作用類(lèi)似，實(shí)際上，在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中，例如來(lái)自前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系中，細(xì)胞和腫瘤組織的侵襲與ESRP1和2的低表達(dá)有關(guān)[27，28，32，33]，表明了ESRPs的腫瘤抑制功能。這一觀點(diǎn)得到了相關(guān)研究的進(jìn)一步支持，有研究表明ESRP1過(guò)表達(dá)在體外減少了胰腺癌細(xì)胞的遷移和增殖，在體內(nèi)很少產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移[33]。此外，臨床數(shù)據(jù)顯示ESRP1表達(dá)水平與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳腺癌中的患者存活率正相關(guān)[32]。在原發(fā)性結(jié)腸腫瘤微衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶中，發(fā)現(xiàn)50%的ESRP1基因突變，體外實(shí)驗(yàn)敲除ESRP1可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，表明ESRP1是結(jié)腸癌的腫瘤抑制因子[34]。

與之相反，ESRP1高表達(dá)和由此產(chǎn)生的CD44v8-10剪切變體與4T1小鼠模型和乳腺癌患者更高肺轉(zhuǎn)移相關(guān)[35]。ESRP1誘導(dǎo)的剪接變體CD44v8-10有穩(wěn)定胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白xCT(SLC7A11)的能力，同時(shí)增加細(xì)胞對(duì)活性氧的抵抗力，使其具有潛在的致癌功能[35]。乳腺癌細(xì)胞缺氧也會(huì)引起ESRP1表達(dá)增加，促進(jìn)向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化，但具體機(jī)制有待明確。ESRP1可促進(jìn)多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系對(duì)抗癌劑苯基丁酸酯(一種組蛋白脫乙酰基酶拮抗劑)的敏感性，因此，ESRP1降低了對(duì)化學(xué)抗性有確定作用的基因表達(dá)，例如AXL，IFI16和CAV1[36]。

關(guān)于ESRP2在腫瘤形成中的作用研究較少。在大多數(shù)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者中，ESRP1和ESRP2均有腫瘤抑制功能，但是作用機(jī)制不同。在這些腫瘤中，ESRP1 mRNA表達(dá)顯著下降，ESRP2 mRNA表達(dá)趨于穩(wěn)定，但是由于Arkadia功能喪失降低了剪接活性，其促進(jìn)了ESRP2誘導(dǎo)的剪接[37]。在HNSCCs中也報(bào)道ESRP1和ESRP2的調(diào)節(jié)，其中ESRP1通過(guò)Rac1剪接調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[29]，而ESRP2影響細(xì)胞-細(xì)胞黏附，有數(shù)據(jù)表明ESRP1 mRNA表達(dá)水平受缺氧條件影響，而ESRP2不受影響?？傊?，大部分研究表明ESRPs具有腫瘤抑制作用，也有研究發(fā)現(xiàn)ESRP1有腫瘤保護(hù)作用，因而ESRP1和ESRP2的調(diào)控機(jī)制及其功能并不完全一致。

5 結(jié)論

ESRPs已成為上皮細(xì)胞剪接程序的主要調(diào)節(jié)因子,它通過(guò)誘導(dǎo)上皮表型改變，從而參與細(xì)胞-細(xì)胞黏附，細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架。闡明ESRPs在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其調(diào)控機(jī)制，將對(duì)深入了解人類(lèi)胚胎發(fā)育和腫瘤的診斷治療過(guò)程具有重大指導(dǎo)意義。