劉文娟， 董 亢， 劉騁躍， 董雙林,2 ??， 周演根,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266235)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)具有肉質(zhì)細(xì)嫩，肥厚刺少，味道鮮美，EPA、DHA等PUFA含量高的特點(diǎn)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖的名貴肉食性魚(yú)類(lèi)之一[1-2]。自20世紀(jì)引進(jìn)虹鱒以來(lái)，我國(guó)虹鱒養(yǎng)殖多以水庫(kù)或淡水池塘養(yǎng)殖為主[3-7]，對(duì)于不同品系虹鱒體內(nèi)脂肪酸含量和不同養(yǎng)殖水體虹鱒的生長(zhǎng)、免疫、一般營(yíng)養(yǎng)成分的比較研究有見(jiàn)報(bào)道[1-2, 8-11]。

近些年，鮭鱒魚(yú)類(lèi)海水工廠化養(yǎng)殖開(kāi)始興起[8]，我國(guó)科技工作者也已開(kāi)始在開(kāi)放的黃海冷水團(tuán)海域養(yǎng)殖包括大西洋鮭(Salmosalar)、洄游型硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)和虹鱒等鮭鱒魚(yú)類(lèi)。有研究表明，與淡水養(yǎng)殖虹鱒相比，經(jīng)鹽度馴化后海水養(yǎng)殖虹鱒的生長(zhǎng)狀況、免疫力和肌肉品質(zhì)均有提高[9-11]。

鮭鱒魚(yú)類(lèi)多是海淡水洄游魚(yú)類(lèi)，淡水中培育的魚(yú)種在進(jìn)入海水養(yǎng)殖之前需要鹽度馴化。魚(yú)類(lèi)主要通過(guò)滲透壓調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)不同鹽度的水體環(huán)境，此過(guò)程需要消耗大量能量。脂質(zhì)作為三大能源物質(zhì)之一，在魚(yú)體供能方面發(fā)揮著重要的作用[12]。脂質(zhì)可以分為極性脂和非極性脂，而非極性脂被認(rèn)為是魚(yú)類(lèi)能量的重要儲(chǔ)存形式[13]。非極性脂主要由三?；视徒M成，此外還包括少量的二酰甘油和?；视蚚14]，多存在于魚(yú)類(lèi)的肌肉、肝臟和腸系膜中，其提供的能量是等重量糖原的5倍[15]。除了提供能量，魚(yú)體內(nèi)非極性脂的含量和脂肪酸組成也會(huì)影響?hù)~(yú)的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，一般認(rèn)為魚(yú)肉的脂肪含量越高，帶給人的香郁、細(xì)膩之感越強(qiáng)[16]。

研究表明，水體鹽度變化會(huì)影響?hù)~(yú)體內(nèi)脂質(zhì)的脂肪酸組成和含量[17]。高滲條件下，金頭鯛 (Sparusauratus) 體內(nèi)甘油三酯含量升高[18]；水體鹽度升高能夠改變金頭鯛和紅點(diǎn)鮭 (Salvelinusalpinus) 體內(nèi)非必需脂肪酸 (NEFA) 含量[18-20]，提高虹鱒[21]和花鱸(Lateolabraxmaculatus)[22]肌肉中EPA和DHA的含量。郭振[23]等對(duì)不同鹽度水體的羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)脂肪酸研究發(fā)現(xiàn)，水體鹽度升高可以提高實(shí)驗(yàn)羅非魚(yú)肌肉中的飽和脂肪酸 (SFA)、單不飽和脂肪酸 (MUFA) 和多不飽和脂肪酸 (PUFA) 含量，提高PUFA/SFA比值，增加羅非魚(yú)脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

鮭鱒魚(yú)類(lèi)的鰓、肌肉和肝臟在滲透壓調(diào)節(jié)和能量供給方面起著十分重要的作用，而此3種組織器官的脂肪酸與滲透壓調(diào)節(jié)和能量供給密切相關(guān)。目前，對(duì)于虹鱒體內(nèi)脂肪酸的研究多集中在種類(lèi)和含量上，而關(guān)于海水馴化對(duì)虹鱒不同組織脂肪酸的影響鮮有報(bào)道[24]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定鹽度馴化前后虹鱒鰓、肌肉和肝臟中非極性脂脂肪酸的組成與含量，發(fā)現(xiàn)鹽度馴化引起的虹鱒3種組織器官內(nèi)非極性脂脂肪酸的變化，探究虹鱒鰓、肌肉和肝臟3種組織器官在鹽度馴化過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)于2017年7月2日～8月9日在中國(guó)海洋大學(xué)魚(yú)山校區(qū)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)材料為三倍體虹鱒，取自山東省日照市萬(wàn)澤豐漁業(yè)有限公司鮭鱒魚(yú)繁育場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)虹鱒先在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周(溫度(16±0.5) ℃，鹽度0)。之后選取60尾生長(zhǎng)狀況良好，規(guī)格相近((195.23±15.75) g)的虹鱒，隨機(jī)分到3個(gè)圓形玻璃纖維水缸(277 L；高58 cm；半徑39 cm)中。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，以每天增加2個(gè)鹽度的速度，將鹽度從0升到30。實(shí)驗(yàn)期間，每天08:00和18:00投喂2次，投喂量為實(shí)驗(yàn)魚(yú)總體重的2%。投喂2 h后吸殘餌糞便、換水，每次換水量為總體積的1/2。水溫控制在(16±0.5) ℃(使用溫控系統(tǒng)，ZKH-WK 2000，中科海水質(zhì)處理有限公司)；氣石充氣，水體溶氧含量6 mg/L以上；光照周期為12 h光照∶12 h黑暗；使用YSI專(zhuān)業(yè)水質(zhì)檢測(cè)儀(Yellow Spring, Ohio, USA)，監(jiān)測(cè)記錄水缸內(nèi)的水溫、溶解氧、酸堿度和鹽度等水質(zhì)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)虹鱒投喂商品飼料，飼料脂肪酸組成如表1所示。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水體水質(zhì)狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)虹鱒未出現(xiàn)受傷、死亡現(xiàn)象。分別對(duì)鹽度變化前(0)和海水(30)適應(yīng)一周后的虹鱒進(jìn)行取樣。取樣前一天停止投喂，每缸隨機(jī)選取3尾魚(yú)。使用麻醉劑MS-222(濃度70 mg/L)將魚(yú)麻醉，取其鰓絲、背肌(胸鰭至臀鰭之間，側(cè)線以上的背部肌肉)和肝臟組織到凍存管，迅速放到液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2 非極性脂脂肪酸的提取和測(cè)定

1.2.1 非極性脂的提取 樣品非極性脂的提取基本參考劉騁躍的方法[24]。取組織樣品0.1 g，加入3.3 mL甲醇溶液，勻漿機(jī)勻漿1 min，加入6.6 mL氯仿溶液，倒入10 mL甲酯化試管中，搖床震蕩30 min(37 ℃, 130 r/min)，漏斗過(guò)濾到新的甲酯化試管，用氯仿/甲醇(2∶1, v/v)混合液定容至10 mL，4 ℃下靜置過(guò)夜。取氯仿層，氮?dú)獯蹈?，用石油醚?fù)溶至10 mL，-20 ℃條件保存。取2 mL油脂和石油醚混合液到4 mL EP管中，氮?dú)獯蹈?，加?0 μL石油醚，用毛細(xì)管吸取，均勻地點(diǎn)在硅膠板(10 cm× 5 cm)上，在極性展開(kāi)劑(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4)中展開(kāi)，用單質(zhì)碘顯色后將極性脂刮下放入甲酯化試管中，加入2 mL甲酯化試劑(HCl-甲醇溶液)，充入氮?dú)猓″佒?0 ℃水浴3 h，加入1 mL色譜級(jí)正己烷，振蕩均勻后靜置，分層后取上層正己烷溶液(含脂肪酸甲酯)，氮?dú)獯蹈桑蒙V級(jí)正己烷復(fù)溶至50 μL，放入氣相色譜進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

表1 餌料中脂肪酸的組成Table 1 Fatty acid composition of the diet /%

1.2.2 脂肪酸的測(cè)定 脂肪酸甲酯的檢測(cè)使用氣相色譜儀(日本島津，GC-2010 plus)，進(jìn)樣量1 μL，檢測(cè)器為火焰電離化檢測(cè)器(日本島津，GC-2010)，氣相色譜柱為RTX-WAX石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm ，膜厚0.25 μm，美國(guó)，Phenomenex)。升溫程序：60 ℃維持1.0 min，以10 ℃/min的升溫速度升到190 ℃，然后以2.0 ℃/min的升溫速度升到260 ℃，維持0.6 min。色譜峰的定性以與37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)品(美國(guó)，Supelco)的保留時(shí)間相比較的方式進(jìn)行，定量采用面積歸一法(外標(biāo)法，5點(diǎn)定標(biāo))。

不飽和指數(shù)(UI)、不飽和率(U/S)的計(jì)算方法如下(Snyder & Hennessey[24-25]; Williams Hazel[24-26])：

UI=∑(% 單烯脂肪酸 + 2 × % 雙烯脂肪酸+3×%三烯脂肪酸 …)/100；

U/S = ∑(% UFA)/ ∑(% SFA)。

式中% 表示其所占百分比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SAS 9.4(SAS Institute Incorporated, Cary, North Carolina, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用t檢驗(yàn)對(duì)鹽度馴化前后不同器官的非極性脂脂肪酸組成進(jìn)行差異性檢測(cè)，P<0.05表示顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)表明，鹽度馴化前后，虹鱒鰓、肌肉和肝臟組織非極性脂脂肪酸的種類(lèi)組成相同。鰓中檢測(cè)出15中脂肪酸，包括4種飽和脂肪酸(SFA)，4種單一不飽和脂肪酸(MUFA)，8種多不飽和脂肪酸(PUFA)。肌肉和肝臟中均檢測(cè)出19種脂肪酸，包括6種SFA，5種MUFA，8種PUFA。3種器官的非極性脂中，SFA所占比例最高的是棕櫚酸(16:0)，其次是硬脂酸(18:0)；MUFA所占比例最高的是油酸(18:1n9)；PUFA所占比例最高的是DHA(22:6n3)，其次是亞油酸(18:2n6)，α-亞麻酸(18:3n3)的占比也相對(duì)較高，然而，EPA(20:5n3)和ARA(20:4n6)的占比并不是很高。

鹽度馴化之后，虹鱒鰓的非極性脂脂肪酸組成變化不顯著(見(jiàn)表2)。與淡水組相比，升鹽組虹鱒鰓的非極性脂中SFA和MUFA比例略有升高，PUFA比例略微下降，但均不顯著。

但鹽度馴化后，虹鱒肌肉的非極性脂脂肪酸變化明顯。相比于淡水組，升鹽組虹鱒肌肉的非極性脂中SFA比例顯著下降(P<0.05)，MUFA比例下降，但不顯著，PUFA比例顯著上升(P<0.05)。PUFA中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，如22:6n3，20:5n3和20:4n6變化不明顯，但18:2n6和18:3n3比例顯著升高(P<0.05)，亞麻酸族不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)和亞油酸族不飽和脂肪酸(n-6 PUFA)比例也明顯升高(P<0.05)，從而導(dǎo)致不飽和指數(shù)(UI)和不飽和率(U/S)的顯著上升(UI,P<0.05; U/S,P<0.05)。

對(duì)于肝臟，鹽度馴化前后虹鱒肝臟的非極性脂脂肪酸變化與肌肉相似。海水組虹鱒肝臟的非極性脂中SFA比例顯著下降(P<0.0.05)，其中的棕櫚酸(16:0)下降明顯(P<0.05)；MUFA比例略有下降，但不顯著，18:2n6和18:3n3的比例顯著上升(P<0.05)，n-3 PUFA和n-6 PUFA的比例也明顯上升(P<0.05)，從而使得PUFA的比例、UI和U/S明顯升高(P<0.05)。

3 討論

當(dāng)外界水體鹽度發(fā)生變化時(shí)，魚(yú)類(lèi)通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，該調(diào)節(jié)過(guò)程消耗大量能量[17]。脂質(zhì)，特別是非極性脂，作為魚(yú)類(lèi)的主要儲(chǔ)能物質(zhì)[27]，是魚(yú)類(lèi)重要的能量供應(yīng)來(lái)源[13,15,17]。

鹽度馴化前后，本實(shí)驗(yàn)虹鱒鰓組織的非極性脂脂肪酸組成未發(fā)生顯著變化(P>0.1)，表明虹鱒的鰓并不是主要的能量供應(yīng)器官。有人研究發(fā)現(xiàn)，鰓是魚(yú)類(lèi)主要的滲透壓調(diào)節(jié)器官，其通過(guò)Na+/K+-ATPase酶實(shí)現(xiàn)對(duì)離子進(jìn)出的控制，Na+/K+-ATPase酶的活性易受到鰓的磷脂脂肪酸的影響，而鰓的非極性脂對(duì)Na+/K+-ATPase酶的活性影響不大[28-30]。如Bystriansky等[31]研究發(fā)現(xiàn)紅點(diǎn)鮭鰓中Na+/K+-ATP酶的活性隨ARA(20:4n6)和DHA(22:6n3)含量的增加而升高。劉騁躍等[24]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒在海水馴化之后鰓組織的磷脂脂肪酸中SPA比例上升，PUFA富集。魚(yú)鰓的非極性脂脂肪酸的組成會(huì)受到飼料成分的影響，但對(duì)周?chē)h(huán)境因子的變化較不敏感[32-33]，如Hansen和Abraham[34]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度的變化和饑餓脅迫均未影響歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)鰓中非極性脂脂肪酸的組成。由于魚(yú)鰓組織的特殊結(jié)構(gòu)，鰓絲細(xì)胞中用于貯存能量的非極性脂含量較少[35]。本實(shí)驗(yàn)中，淡水組和升鹽組虹鱒鰓的非極性脂脂肪酸組成為均為15種，少于肌肉和肝臟的19種，且每種脂肪酸的占比沒(méi)有顯著差異，這可能是鰓本身非極性脂含量低，鰓的主要功能是吸收和排泄離子，而不是供應(yīng)能量。

與鰓組織不同，本實(shí)驗(yàn)虹鱒的肌肉和肝臟中，非極性脂脂肪酸組成在經(jīng)歷鹽度馴化后，SFA占比顯著下降(P<0.05)，PUFA顯著上升(P<0.05)，使得肌肉和肝臟非極性脂的UI和U/S顯著升高(P<0.05)。這可能是實(shí)驗(yàn)虹鱒為適應(yīng)高鹽水體環(huán)境，優(yōu)先分解利用以16:0為主的SPA調(diào)節(jié)滲透壓，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。曾霖[6]等也發(fā)現(xiàn)增加水體鹽度可提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚(yú)肌肉中的PUFAs和EPA+DHA等含量，同時(shí)降低SFA總量。花鱸(Lateolabraxjaponicus)[36]、大西洋鮭(Salmosalar)[37]、遮目魚(yú)(Chanoschanos)[38]等也表現(xiàn)出類(lèi)似現(xiàn)象。Hagen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)主要利用體內(nèi)不同組織脂肪中的SFA和MUFA供能，從而節(jié)約了機(jī)體蛋白質(zhì)與脂肪中的PUFA，以維持重要的生命活動(dòng)。Mellery等[39]發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體內(nèi)脂肪酸的代謝順序一般是：SPA>MUFA>PUFA>LC-PUFA、n-6 PUFA> n-3 PUFA。此外，魚(yú)類(lèi)在適應(yīng)海水過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)分泌多種激素，如生長(zhǎng)激素、血管緊張激素、皮質(zhì)類(lèi)固醇等，也會(huì)間接影響多不飽和脂肪酸的生物合成。Zheng等[40]發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭入海時(shí)，肌肉內(nèi)Δ 6去飽和酶的表達(dá)顯著升高，從而使其在入海后PUFA含量大幅升高。Sheridan等[41]的研究也發(fā)現(xiàn)，淡水生活的硬頭鱒體內(nèi)PUFA的含量顯著低于海水生活的硬頭鱒，并且Δ 5去飽和酶的活性顯著上升。Bell等發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭幼魚(yú)在向海水過(guò)渡和滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中會(huì)調(diào)控食物選擇，以增加體組織中的ARA及其產(chǎn)生的類(lèi)花生酸類(lèi)物質(zhì)[42]。ARA和類(lèi)花生酸類(lèi)物質(zhì)在鮭鱒魚(yú)幼魚(yú)的銀化入海過(guò)程中發(fā)揮重要作用[43]。

表2 鹽度馴化前(淡水組FW)后(升鹽組SW)虹鱒鰓、肌肉、肝臟非極性脂脂肪酸組成Table 2 Fatty acid compositions of non-polar lipid in the gill, muscle and liver of rainbow trout before (freshwater FW) and after (seawater SW) acclimation /%

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同行中帶有“*”表示具有顯著差異(P<0.05)。FW：淡水處理組；SW：升鹽處理組；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：?jiǎn)我徊伙柡椭舅?；PUFA：多不飽和脂肪酸；n-3 PUFA：亞麻酸族不飽和脂肪酸；n-6 PUFA：亞油酸族不飽和脂肪酸；UI：不飽和指數(shù)；U/S：不飽和率。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”. FW: Freshwater treatment; SW: Seawater treatment; SFA: Saturated fatty acid; MUFA: Monounsaturated fatty acids; PUFA: Polyunsaturated fatty acid; n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid; n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid; UI: Unsaturated index; U/S: The ratio of unsaturated and saturated fatty acid.

本實(shí)驗(yàn)中，鹽度馴化后，虹鱒肌肉和肝臟的非極性脂中EPA、DHA和ARA占比略有升高，但不顯著(P>0.1)；而18:2n6和18:3n3等C18 PUFA的比例顯著上升(P<0.05)。先前研究表明，魚(yú)體內(nèi)的內(nèi)源性LC-PUFA通常由其C18 PUFA前體經(jīng)去飽和作用和碳鏈延長(zhǎng)作用合成[44]，并且C18 PUFA可作為脂代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的配體，參與激活LC-PUFA關(guān)鍵基因的表達(dá)[45]。鹽度馴化后，虹鱒肌肉和肝臟非極性脂中18:2n6和18:3n3的增加，可能會(huì)提高它們轉(zhuǎn)化為EPA和DHA的速率，有助于虹鱒體內(nèi)LC-PUFA的生物合成，利于虹鱒的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)語(yǔ)

鹽度馴化前后，虹鱒鰓、肌肉和肝臟中的非極性脂脂肪酸會(huì)產(chǎn)生組織特異性變化。經(jīng)歷鹽度馴化，虹鱒鰓中非極性脂脂肪酸變化不顯著，因此，鰓不是滲透調(diào)節(jié)的主要能量供應(yīng)器官。肌肉和肝臟的非極性脂中大量SPA被分解代謝，為虹鱒調(diào)節(jié)滲透壓，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定提供能量。與淡水虹鱒相比，經(jīng)鹽度馴化的虹鱒肌肉和肝臟中的n-3 PUFA和n-6 PUFA比例顯著上升，C18 PUFA作為L(zhǎng)C-PUFA的合成前體，其比例的上升可能會(huì)加快肌肉和肝臟中EPA、DHA和ARA等的生物合成，有利于虹鱒對(duì)海水環(huán)境的適應(yīng)。