李 樂， 樊 英， 王曉璐， 于曉清， 于道德， 蓋春蕾， 葉海斌， 許 拉， 王勇強， 刁 菁??

(1.山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104；2.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104； 3.日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司，山東 日照 250000)

硬頭鱒(Oncorhynchusmykis)屬鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)太平洋鮭屬(Oncorhynchus)，適宜生長溫度為12～18 ℃，屬典型的冷水性魚類。硬頭鱒和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為同一種，虹鱒為陸封型，硬頭鱒為洄游型(廣鹽性)，具有生長快、個體大、性成熟時間晚等優(yōu)良性狀[1]。隨著黃海冷水團的開發(fā)利用，離岸養(yǎng)殖項目的推進，山東近海成為海上養(yǎng)殖冷水性魚類的橋頭堡，黃海冷水團綠色健康養(yǎng)殖已頗具規(guī)模，硬頭鱒近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖成為近期研究熱點[2-4]。硬頭鱒內(nèi)陸淡水孵化，幼魚生長至100 g后轉(zhuǎn)移至沿海車間，分梯度進行海水馴化，目前該養(yǎng)殖技術(shù)基本成熟，并在山東得到大規(guī)模應(yīng)用。

麻醉可以降低魚體呼吸頻率和耗氧量，減少魚的應(yīng)激反應(yīng)，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于運輸、催產(chǎn)、標(biāo)記、免疫等漁業(yè)活動中。目前常用的魚類麻醉劑有MS-222,苯氧乙醇，丁香油，喹哪啶等，其中MS-222，化學(xué)名稱為間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，為白色晶體粉末，易溶于水，對魚、人較安全，被FDA規(guī)定為水產(chǎn)專用麻醉劑。目前已有報道使用MS-222麻醉美洲鰣(Alosasapidissima)[5]、許氏平鮋(Sebastesschlegeli)[6]、半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGünther)[7]、黑鯛(Sparusmacrocephalus)[8]等。關(guān)于硬頭鱒或者虹鱒，僅康玉軍[9]報道了MS-222麻醉1齡虹鱒，但其實驗條件與近海冷水團相差較大，有關(guān)溫度對使用MS-222麻醉硬頭鱒幼魚的影響尚未見于報道。本研究設(shè)置了3個溫度進行了麻醉試驗，模擬硬頭鱒養(yǎng)殖中3個不同時期的養(yǎng)殖水溫，研究MS-222對硬頭鱒的麻醉效果，為冷水魚免疫、運輸、催產(chǎn)等漁業(yè)生產(chǎn)活動篩選一種適宜的麻醉劑并提供可靠的實用技術(shù)參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚：試驗用硬頭鱒取自山東省日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司，平均體重(50±5) g。試驗開始前于循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)3 d。

試驗用麻醉劑：MS-222為 Fluka公司生產(chǎn)，配置質(zhì)量濃度約為0.1 mg/L的母液，麻醉試驗時按照試驗設(shè)計濃度將母液進行稀釋。

試驗條件：硬頭鱒于塑料缸(80 cm×70 cm×50 cm)中淡水飼養(yǎng)，每箱30尾，本試驗使用曝氣2 d以上的自來水，各試驗組水溫調(diào)控參考菅玉霞[10]方法，通過控溫儀(WEIPRO MX300 IC)來調(diào)控，試驗期間溫度波動±0.5 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 MS-222對硬頭鱒最終麻醉狀態(tài)的測定 試驗設(shè)置10、20、40、60、80、100和120 mg/L 7個濃度梯度，實驗溫度為8 ℃，每個濃度設(shè)置3個平行，每個平行用魚30尾，測定魚體20 min達(dá)到最終麻醉程度并觀察魚體的麻醉行為特征。

1.2.2 不同溫度下MS-222對硬頭鱒麻醉影響的測定 設(shè)置3個溫度梯度(8、12和16 ℃)，以5個MS-222濃度梯度(40、50、60、70和80 g/mL)進行試驗，并及空白對照，分別測定麻醉時間、復(fù)蘇時間、呼吸頻率，每個實驗設(shè)置3個平行，每個平行30尾。

1.2.3 麻醉劑對呼吸頻率影響的測定 單位時間內(nèi)魚體鰓蓋的張合次數(shù)，稱為魚體呼吸頻率，故計數(shù)試驗所設(shè)置觀察時間的前后各10 s內(nèi)的鰓蓋的張合次數(shù)，記錄為呼吸次數(shù)(次/20 s)。初始呼吸頻率為將硬頭鱒收容至盛有40 L清水的塑料箱中，放置10 min后的呼吸頻率。然后將設(shè)指定質(zhì)量濃度的MS-222加入水體中，在不同麻醉時間分別測定呼吸頻率。觀察時間為1、5、10和15 min，每次隨機觀察3尾，計算3個平行每個數(shù)據(jù)的平均值，作為該條件下的呼吸頻率。

1.2.4 麻醉、休克與復(fù)蘇時間的測定 觀察各個條件下硬頭鱒的行為表現(xiàn)，達(dá)到休克后立即轉(zhuǎn)入清水中復(fù)蘇，記錄達(dá)到IV期麻醉、休克狀態(tài)所需時間；休克后將試驗魚轉(zhuǎn)入清水中，記錄復(fù)蘇時間和成活率。參考關(guān)健[11]劃分麻醉、復(fù)蘇的時期。

麻醉劑理想濃度的標(biāo)準(zhǔn)為：魚體在麻醉劑中3 min之內(nèi)達(dá)到麻醉期，5 min之內(nèi)復(fù)蘇，且成活率100%的濃度[12]。

1.2.5 長期麻醉試驗 將硬頭鱒在不同條件下浸浴24 h(試驗期間不換水，以充氣泵增氧)，本試驗設(shè)置了4個濃度梯度(40、50、60和80 mg/L)以及3個溫度梯度(8、12和16 ℃)，在1、3、6、12和24 h觀察存活情況，記錄成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 所得數(shù)據(jù)用Excel作圖、SPSS18.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚體在不同濃度MS-222下達(dá)到的最終麻醉狀態(tài)

根據(jù)所觀察到的魚體行為特征，參考官曙光等[6]將硬頭鱒的麻醉過程分為6個時期，復(fù)蘇過程分為4個時期。8 ℃條件下，硬頭鱒浸浴在不同MS-222濃度20 min后達(dá)到的最終麻醉程度見圖1。魚體浸浴的最終麻醉程度隨著濃度的增加而上升。MS-222濃度在10 mg/L時，最終麻醉程度為1期，在20、30 mg/L時為2期，在40 mg/L時達(dá)到3期，在50 mg/L時達(dá)到4期，在60、80 mg/L時為5期，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L時，最終麻醉程度達(dá)到了6期，即休克狀態(tài)，若不及時復(fù)蘇，魚體死亡。當(dāng)濃度在50、60、80和100 mg/L時，成活率為100%，分析認(rèn)為，MS-222在8 ℃條件下麻醉硬頭鱒的有效質(zhì)量濃度范圍為50～100 mg/L。

圖1 8 ℃不同濃度MS-222麻醉硬頭鱒能達(dá)到的最終程度Fig.1 Ultimate anaesthetic stage of Steelhead Trout in different MS-222 concentrations at 8 ℃

2.2 MS-222在不同溫度下對硬頭鱒呼吸頻率的影響

不同濃度MS-222在8、12和16 ℃下對硬頭鱒呼吸頻率的影響見表1。一般情況下，呼吸頻率隨著溫度升高逐漸升高。在各個溫度條件下，麻醉程度處于4期之前時，魚體會出現(xiàn)呼吸頻率加快的情況，達(dá)到麻醉4期后，呼吸頻率略微減弱且穩(wěn)定，當(dāng)?shù)竭_(dá)麻醉5期時，呼吸頻率迅速下降，且出現(xiàn)呼吸間斷性，當(dāng)達(dá)到麻醉6期后，呼吸頻率降為0，達(dá)到休克狀態(tài)。

8 ℃：試驗魚在40 mg/L時濃度時，呼吸頻率略高于對照組；在50、60、70和80 mg/L組，呼吸頻率逐漸降低，隨著濃度的升高降低的幅度越大，且進入4期時間縮短；當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/L時，呼吸頻率顯著下降，并在5 min內(nèi)達(dá)到休克狀態(tài)。

12 ℃：試驗魚在40 mg/L時濃度時，呼吸頻率與對照組無顯著差異；在50、60和70 mg/L組，呼吸頻率逐漸降低，隨著濃度的升高降低的幅度越大，且進入4期時間縮短；當(dāng)濃度達(dá)到80、100 mg/L時，呼吸頻率顯著下降，并在15和5 min達(dá)到休克狀態(tài)。

表1 MS-222在不同濃度下對硬頭鱒呼吸頻率的影響Table 1 Respiratory frequencies of Steelhead Trout in different MS-222 concentrations at different temperature

注：“-”代表呼吸停止, 進入休克狀態(tài)。Note:“-”：Shock stage.

16 ℃：試驗魚在40、50、60和70 mg/L組，呼吸頻率逐漸降低，隨著濃度的升高降低的幅度越大，且進入4期時間縮短；當(dāng)濃度達(dá)到80、100 mg/L時，呼吸頻率顯著下降，并分別在10和5 min內(nèi)達(dá)到休克狀態(tài)。

2.3 MS-222在不同溫度下對硬頭鱒麻醉及復(fù)蘇時間

MS-222在不同溫度下對硬頭鱒麻醉時間結(jié)果見圖2。試驗所設(shè)置的濃度除40 mg/L濃度在8 ℃條件下外均可使魚體達(dá)到麻醉4期。麻醉劑的濃度越大，硬頭鱒進入麻醉4期時間越短，并且溫度的提高能縮短相應(yīng)的入麻時間。8 ℃時，當(dāng)濃度為40 mg/L時，不能進入麻醉4期，而50 mg/L時，進入麻醉4期時間>180 s，當(dāng)濃度≥60 mg/L時，魚體都能夠在180 s之內(nèi)達(dá)到麻醉4期；當(dāng)溫度提升到12 ℃后，處于40 mg/L的硬頭鱒也可以進入麻醉4期，但時長>180 s，而當(dāng)濃度≥50 mg/L時，均可使魚體在180 s之內(nèi)達(dá)到麻醉4期。

MS-222在不同溫度下對硬頭鱒復(fù)蘇時間結(jié)果見圖3。當(dāng)魚體達(dá)到麻醉4期后，開始進行復(fù)蘇，發(fā)現(xiàn)相同溫度下麻醉劑濃度越高，復(fù)蘇時間越長，而相同濃度下，溫度越高復(fù)蘇時間越長。

圖2 不同溫度下硬頭鱒在不同濃度 MS-222麻醉后的復(fù)蘇時間Fig.2 Recovery times for Steelhead Trout in different MS-222 concentrations at different temperature

圖3 硬頭鱒不同溫度下不同濃度達(dá)到麻醉4期的時間Fig.3 Anaesthetic durations(Stage IV)for Steelhead Trout in different MS-222 concentrations at different temperature

2.4 MS-222在不同溫度下長期麻醉結(jié)果

MS-222在不同溫度下對硬頭鱒長期麻醉結(jié)果見表2。將硬頭鱒浸浴在不同條件下24 h后轉(zhuǎn)入清水中。結(jié)果顯示，在3個溫度條件下，濃度為40、50 mg/L的MS-222均不會引起魚體死亡；60 mg/L濃度的MS-222在16 ℃時會有死亡出現(xiàn)；而長時間浸浴在80 mg/L濃度中，魚體均會出現(xiàn)死亡，且隨溫度的升高，死亡現(xiàn)象出現(xiàn)的越早，最終成活率越低。而浸浴24 h后的復(fù)蘇時間均顯著高于短時間麻醉復(fù)蘇時間，且隨著溫度和濃度的升高，復(fù)蘇時間越長。

表2 MS-222在不同溫度下對硬頭鱒長期麻醉成活率的影響Table 2 Survival rate of Steelhead Trout in different MS-222 concentrations at different temperature after long-time anesthetic

3 討論

3.1 魚體在不同濃度MS-222下達(dá)到的最終麻醉狀態(tài)

魚體進入麻醉后的呼吸頻率是反應(yīng)麻醉深度的重要指標(biāo)，呼吸頻率慢則麻醉程度深，。目前關(guān)于麻醉對魚體呼吸頻率的影響，大多數(shù)報道例如MS-222麻醉許氏平鲉[6]、黑鯛[8]、金魚(Carassiusauratus)[13]、美洲鰣[5]或用丁香油麻醉黃臘鲹(Trachinotusblochii)[14]、黑鱸(Micropterussalmoide)[15]、許氏平鲉[11]時，都會出現(xiàn)呼吸頻率不斷下降的現(xiàn)象；而用MS-222麻醉長鰭吻鮈(Rhinogobioventralis)時[16]，用喹哪啶麻醉狼鱸(Dicentrarchuslabrax)[17]時，呼吸頻率在低度麻醉時顯著上升，深度麻醉急劇下降。本試驗中當(dāng)麻醉濃度較低或者時間較短，魚體麻醉程度處于4期之前時，魚體會出現(xiàn)呼吸頻率加快的情況，隨著時間或者濃度的升高，到達(dá)麻醉5期時，呼吸頻率顯著下降，直至呼吸停止，與多數(shù)研究相一致。

3.2 溫度對MS-222麻醉硬頭鱒效果的影響

溫度是影響麻醉效果的重要因素，隨著溫度的升高，機體代謝旺盛，心跳和呼吸頻率均加快，麻醉藥液經(jīng)過鰓絲滲透的速率隨之加快。Marking等[12]認(rèn)為：在相同的麻醉劑含量下，水溫升高，魚體到達(dá)最終麻醉狀態(tài)的時間縮短，入麻時間隨溫度的增加而減小，這一觀點被廣泛接受[18-22]；而金一春等[23]認(rèn)為二氧化碳對白斑狗魚的入麻時間隨溫度的增加而下降，這一現(xiàn)象近年來亦有報道[24-25]。本試驗中隨著溫度升高硬頭鱒達(dá)到麻醉4期所需的麻醉劑濃度降低或者浸泡時間減少，與多數(shù)的研究報道相一致[26]。

與溫度對麻醉時間影響不同的是，溫度對復(fù)蘇時間的影響也存在著分歧。部分研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度提高，同一濃度下復(fù)蘇時間明顯增加，如美洲鰣[5]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[19]、四指馬鲅(Eleutheronemarhadinum)[18]、鯉魚(Cyprinnscarpio)[22]；同時也有報道，復(fù)蘇時間隨水溫的降低而增加，如羅非魚(Oreochromisnoloticus)[22]，泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[27]，孔雀魚(Poeciliareticulata)[21]、雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×Acipenserbaerii♂)[25]；而趙明[20]等研究表明，溫度對圓斑星鰈(Veraspervarigeatus)的復(fù)蘇時間無明顯差異。本試驗中，各濃度在溫度升高時，硬頭鱒復(fù)蘇時間均有所增加。這可能是跟物種生活習(xí)性及適應(yīng)溫度有關(guān)，關(guān)于溫度對麻醉效果影響的機理，有待進一步研究。

3.3 MS-222對硬頭鱒長時間麻醉的影響

硬頭鱒是一種性情相對暴躁的冷水魚，應(yīng)急性強，耗氧率高，導(dǎo)致在運輸過程中容易死亡，選擇合適的麻醉濃度進行長時間運輸，保證其成活率具有重要的現(xiàn)實意義。康玉軍[9]推薦1齡虹鱒進行24h麻醉時，使用MS-222濃度為60 mg/L。資料表明，當(dāng)魚體進入深度麻醉期后，魚體失去平衡，沉到底部后，在長途運輸過程中，這會增加機體與容器沖撞機會，水質(zhì)迅速惡化，或者魚體相互擠壓造成死亡，并增加運輸后水霉的發(fā)生率和致死率，而低度麻醉期更適用于運輸[15,17,26]。因此本試驗推薦 40～50 mg/L MS-222 麻醉液浸浴適用于硬頭鱒 24 h 內(nèi)的長期操作,硬頭鱒在60mg/L的有效操作時間不超過6 h，80 mg/L 的MS-222中有效操作時間不超過3h。具體操作參考水溫條件進行調(diào)整。

4 結(jié)語

本文研究了不同溫度條件下MS-222對硬頭鱒幼魚的麻醉效果，符合理想麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)，麻醉效果和有效濃度與水溫密切相關(guān)。研究結(jié)果為在養(yǎng)殖生產(chǎn)、免疫、運輸、育種等操作中使用MS-222麻醉魚體降低應(yīng)激反應(yīng)，提供了數(shù)據(jù)和參考。