楊麗飛 王萍 馬蘇亞

糖尿病腎?。―N）是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要并發(fā)癥之一[1]。目前臨床上對于DN治療僅能夠延緩其進(jìn)展，并不能完全阻止或逆轉(zhuǎn)疾病病程。有基礎(chǔ)研究通過建立DN動物模型并針對腎臟炎癥、纖維化和氧化應(yīng)激等多種分子途徑進(jìn)行模擬治療，療效不明顯[2]，故開拓新的治療方法仍是當(dāng)前DN基因治療的研究熱點，而超聲靶向破壞微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種安全且高效的治療手段為DN基因治療提供了新思路，本文就UTMD技術(shù)及其在DN基因治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 DN的基因治療

基因治療是一種具有廣泛前景的靶向性生物治療手段，用于治療包括DN在內(nèi)的各種疾病。與藥物治療所提供的短期效果不同，基因治療可以提供更為持久的治療效果，其針對性強(qiáng)、不良反應(yīng)小。

Steven等[3]為了探究AC261（一種高選擇性視黃酸受體β2激動劑）在高脂喂養(yǎng)DN小鼠模型中的治療作用，予模型小鼠AC261治療12周后發(fā)現(xiàn)，DN小鼠耐受性良好且無明顯不良反應(yīng)。與單純高脂喂養(yǎng)的DN小鼠相比，AC261治療后的高脂喂養(yǎng)DN小鼠血糖控制改善，蛋白尿和尿白蛋白與肌酐比值降低；且在該組小鼠中，DN的許多細(xì)胞特征有所改善，包括腎小管脂滴減少，內(nèi)皮細(xì)胞塌陷、系膜擴(kuò)張和腎小球基底膜增厚情況好轉(zhuǎn)。此外，經(jīng)超微結(jié)構(gòu)和免疫組化分析顯示，經(jīng)AC261治療后的小鼠足細(xì)胞足突和裂隙膈膜形態(tài)保持，足細(xì)胞裂隙膜蛋白和轉(zhuǎn)錄因子WT1水平升高。上述結(jié)果說明AC261在高脂喂養(yǎng)DN模型小鼠的治療中起積極作用。Wang等[4]使用腎近端小管特異性p53敲除和pifithrin-α（p53抑制劑：PIF）治療的糖尿病小鼠模型研究了p53抑制DN腎纖維化的作用，發(fā)現(xiàn)在人腎小管上皮細(xì)胞中，PIF對p53的抑制降低了高糖誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)積累，逆轉(zhuǎn)了高糖對lncRNA鋅指E-box結(jié)合同源框1-反義RNA 1（ZEB1-AS1）和ZEB1 mRNA表達(dá)水平的抑制作用。上述發(fā)現(xiàn)也通過DN患者腎活檢標(biāo)本得到驗證。說明腎近端小管細(xì)胞中p53的藥理抑制和基因缺失可以減輕鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN小鼠腎功能障礙、小管上皮細(xì)胞破壞和間質(zhì)纖維化，表明p53可能是DN腎纖維化的治療靶點。

然而，缺乏安全有效的基因運輸途徑限制了基因療法應(yīng)用于DN臨床試驗。雖然病毒載體的轉(zhuǎn)染效率高，但是它存在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、致癌等臨床問題。因此，尋找安全、有效且高度靶向的基因載體是推進(jìn)基因治療應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。

2 UTMD技術(shù)的應(yīng)用研究

2.1 UTMD作用機(jī)制 UTMD 是一種新興的靶向藥物與基因轉(zhuǎn)運方法，是目前公認(rèn)的靶向介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染和藥物運輸?shù)挠行Х椒āTMD是指在超聲介導(dǎo)下可實現(xiàn)微泡攜帶藥物的靶向釋放或通過微泡的靶向破壞使病灶區(qū)域藥物聚集，增加病灶區(qū)域藥物的靶向釋放，提高藥效并減少藥物全身不良反應(yīng)。

UTMD技術(shù)及靶向轉(zhuǎn)運機(jī)制主要是在超聲介導(dǎo)下微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)[5]?？栈?yīng)則指當(dāng)介質(zhì)中微泡暴露在超聲輻照下，隨著超聲頻率的變化產(chǎn)生周期性“膨脹-壓縮”。在低強(qiáng)度聲場中，微泡在細(xì)胞附近緩慢均勻振動，產(chǎn)生微流、微噴射等聲學(xué)效應(yīng)，這種空化效應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增加或細(xì)胞膜損傷，并且在細(xì)胞膜表面形成許多大小不等、數(shù)量不一的小孔，即聲孔效應(yīng)[6]?？栈?yīng)及聲孔效應(yīng)可以促進(jìn)基因和藥物進(jìn)一步外滲、滲透和細(xì)胞吸收。

2.2 UTMD與基因治療 超聲介導(dǎo)的基因傳遞是一種非侵入性的基因靶向轉(zhuǎn)染方法，可用于傳遞病毒和非病毒載體。超聲微泡造影劑是一種非病毒載體，與其他非病毒基因轉(zhuǎn)染方法相比，其制備簡單、載基因量大、轉(zhuǎn)染率高且無免疫原性，可重復(fù)使用且安全性高。

UTMD技術(shù)為心血管疾病的治療提供了一種非侵入性和非病毒載體的方法，可以有效地將質(zhì)粒運送到目標(biāo)區(qū)域。有學(xué)者為了研究抗凋亡基因survivin在心力衰竭中的治療作用，通過建立由多柔比星誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型并聯(lián)合UTMD技術(shù)進(jìn)行survivin靶向轉(zhuǎn)運的抗凋亡基因治療[7]。通過PCR、免疫組織化學(xué)、超聲心動圖和侵入性血流動力學(xué)檢查并分析發(fā)現(xiàn)，UTMD聯(lián)合survivin治療模型大鼠左心室短軸縮短率顯著升高；此外，實驗組TUNEL和caspase活性的降低以及心肌間質(zhì)纖維化的減少提示心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡減少。上述實驗說明協(xié)同UTMD技術(shù)為心血管疾病的治療提供了一個有效治療方法，利用超聲微泡為非病毒載體進(jìn)行基因的靶向轉(zhuǎn)染可以增強(qiáng)維持心臟功能和恢復(fù)缺血心肌供血的必須因子。

近年來，UTMD介導(dǎo)的基因治療腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)廣泛，如在肝細(xì)胞肝癌、鱗狀細(xì)胞癌、腎癌等治療方面均獲顯著效果；三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性乳腺癌，由于缺乏孕激素受體、雌激素受體和HER2的表達(dá)，其復(fù)發(fā)率比其他乳腺癌亞型顯著增高，總體生存率也顯著縮短。為提高TNBC的治療效果，Sun等[8]研制了一種新型的多功能陽離子卟啉接枝脂質(zhì)微泡并載有低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）siRNA。這種微泡載藥量高且藥物提前釋放少，通過實時超聲成像可以輕松監(jiān)控微泡的分布。此外，通過聯(lián)合UTMD技術(shù)，該微泡可以在原位高效轉(zhuǎn)化為納米顆粒，通過空化效應(yīng)促進(jìn)卟啉和siRNA在腫瘤部位的積累。HIF-1α siRNA可以下調(diào)HIF-1α水平，進(jìn)而增強(qiáng)光動力療法療效以及部分抑制腫瘤發(fā)展。因此，UTMD聯(lián)合光動力療法和基因治療被認(rèn)為是TNBC有效的治療策略。

除心血管、腫瘤領(lǐng)域外，UTMD介導(dǎo)的基因治療亦在其他領(lǐng)域扮演重要角色。Xiang等[9]為了研究經(jīng)UTMD介導(dǎo)的胰島素樣生長因子1（IGF-1）cDNA和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染對大鼠跟腱損傷的保護(hù)作用。治療后發(fā)現(xiàn)，IGF-1+TGF-β+UTMD組模型大鼠黏附指數(shù)得分最低、炎癥程度最輕、4，6-二氨基吲哚核計數(shù)信號最高、IGF-1表達(dá)最高以及TGF-β表達(dá)最低；UTMD組比無UTMD組具有更高的轉(zhuǎn)染效率，且該組的模型大鼠最大荷載和拉應(yīng)力均大于其他組。總之，IGF-1和TGF-β聯(lián)合應(yīng)用UTMD是一種有前途的體內(nèi)肌腱損傷治療方法。

UTMD技術(shù)所介導(dǎo)的基因治療為各種疾病的治療煥發(fā)了新的活力，因其安全、無創(chuàng)、高效且使用簡單應(yīng)用越來越廣泛，也因微泡與超聲相結(jié)合所產(chǎn)生的獨特效應(yīng)使得特定區(qū)域病灶的成像與治療一體化，真正做到了同時監(jiān)測疾病進(jìn)展并予以治療的效果。

3 UTMD在DN基因治療中的應(yīng)用

UTMD作為一種新進(jìn)基因轉(zhuǎn)染介導(dǎo)技術(shù)，為DN基因治療提供了一種新思路[10-25]。TGF-β/MAD的同系物（SMAD）和NF-κB信號通路在DN炎癥及腎纖維化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Chen等[10]研究Smad7在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中的保護(hù)作用時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UTMD介導(dǎo)的Smad7轉(zhuǎn)染可顯著降低DN小鼠微量白蛋白尿，減緩了TGF-β/Smad3信號通路介導(dǎo)的腎纖維化以及NF-κB/p65信號通路介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。隨后，Ka等[11]進(jìn)一步確定通過UTMD技術(shù)協(xié)同Smad7基因治療能夠明顯抑制db/db小鼠糖尿病腎損傷，且實驗證明通過過表達(dá)Smad7所改善的2型糖尿病腎損傷與顯著抑制腎臟中TGF-β/SMAD和NF-κB信號通路的激活有關(guān)。該研究結(jié)果清楚地表明利用UTMD技術(shù)聯(lián)合腎靶向Smad7基因轉(zhuǎn)染可以通過同步調(diào)節(jié)TGF-β/SMAD和NF-κB信號通路來治療2型DN。

近年來發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在多種腎臟疾病中的修復(fù)中扮演重要角色，Marcelo等[12]也證實了可以通過體外MSCs移植控制DN發(fā)生、發(fā)展。然而經(jīng)靜脈移植的MSCs在DN腎臟中檢出率很低且難以到達(dá)病變組織，這在極大程度上阻礙了MSCs對損傷腎臟的治療作用，限制了干細(xì)胞治療的有效開展。張翊等[13]發(fā)現(xiàn)通過聯(lián)合UTMD技術(shù)可以促進(jìn)靜脈移植MSCs腎靶向歸巢從而對DN大鼠產(chǎn)生治療效果。結(jié)果表明通過外源性MSCs移植可以減輕腎小管和間質(zhì)損害，而聯(lián)合UTMD技術(shù)可以促進(jìn)MSCs遷移、歸巢至腎間質(zhì)，強(qiáng)化MSCs治療效果。此外，該團(tuán)隊通過進(jìn)一步實驗證明UTMD可增加早期DN大鼠腎間質(zhì)毛細(xì)血管通透性且無出血壞死等不良反應(yīng)，提示UTMD可能是促進(jìn)藥物、基因、抗纖維化藥物或干細(xì)胞進(jìn)入腎臟的一種有效且安全的治療方法[14]。骨髓MSCs（BMSCs）的遷移和存活主要取決于局部腎臟微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)。Wang等[15]證明適當(dāng)微泡介導(dǎo)的超聲輻照可引起腎臟微環(huán)境的改變，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs對糖尿病腎臟的歸巢能力，且不會引起腎毒性和細(xì)胞損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）與其特異性受體CXCR-4可以促進(jìn)MSCs靶向歸巢，且能增加MSCs在體內(nèi)的生存效率、抑制MSCs凋亡等作用，從多方面提高M(jìn)SCs的靶向治療效果[16]。吳盛正[17]通過將SDF-1與微泡共價連接，經(jīng)靜脈注射并通過超聲靶向爆破釋放SDF-1至DN大鼠模型左側(cè)腎臟。與正常大鼠相比，DN大鼠接受UTMD處理后靶向釋放SDF-1后24h MSCs對DN腎臟的靶向歸巢顯著改善。隨后，王龔[18]使用UTMD協(xié)同脂質(zhì)體誘導(dǎo)CXCR-4基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入BMSCs，并經(jīng)靜脈移植入DN大鼠腎臟并聯(lián)合超聲輻照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載CXCR-4質(zhì)?？梢猿晒D(zhuǎn)染和表達(dá)于細(xì)胞且聯(lián)合UTMD技術(shù)協(xié)同脂質(zhì)體可以顯著增加CXCR-4基因在外源BMSCs的轉(zhuǎn)染效率。此外，聯(lián)合UTMD技術(shù)能夠增加CXCR-4所修飾BMSCs靶向歸巢DN大鼠腎臟的效率，進(jìn)一步通過抑制TGF-β1和TNF-α的表達(dá)從而改善DN大鼠腎功能。UTMD技術(shù)可以利用超聲輻照或協(xié)同其他介質(zhì)增加靜脈移植BMSCs在糖尿病腎臟的靶向歸巢效率并提高DN的治療效果，該技術(shù)為今后DN預(yù)防和治療提供了一種無創(chuàng)、安全且高效的新方法和新思路。

研究表明在體外條件下，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白（CTLA-4-Ig）可通過對抗高糖環(huán)境進(jìn)而恢復(fù)足細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)和活性，且進(jìn)一步實驗證明CTLA-4-Ig可改善甚至消除DN大鼠體內(nèi)蛋白尿的發(fā)生[19]。鄒春鵬[20]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)UTMD技術(shù)聯(lián)合CTLA-4-Ig可進(jìn)一步改善DN大鼠腎臟功能，提高該基因原有的生物學(xué)效應(yīng)。Kallistatin（KS）是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗炎、抗血管生成和抗氧化的特性，而氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位。Yiu等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)UTMD技術(shù)誘導(dǎo)DN小鼠腎小管內(nèi)KS過表達(dá)可通過多種機(jī)制包括抑制氧化應(yīng)激、抗纖維化和抗炎作用、降低血壓等對DN起腎保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在DN發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)控作用，這使它成為目前UTMD介導(dǎo)的基因靶向轉(zhuǎn)染中的研究熱點。Zhong等[22]利用UTMD技術(shù)將microRNA-21敲除的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到10周齡db/db小鼠的糖尿病腎臟中并予以治療10周發(fā)現(xiàn)，DN小鼠腎臟Smad7表達(dá)維持正常水平且TGF-β和NF-κB信號通路的激活受到抑制；DN小鼠的腎臟功能改善、腎臟炎癥、微量白蛋白尿和纖維化減少。MicroRNA-29b是TGF-β/Smad3信號通路所誘導(dǎo)纖維化的下游抑制劑，可作為纖維化的生物標(biāo)記物，由此推測該基因具有治療DN的潛力。Chen等[23]通過聯(lián)合UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)microRNA-29b質(zhì)粒至DN小鼠腎臟并升高腎臟其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)microRNA-29b能夠抑制TGF-β所誘導(dǎo)的纖維化和NF-κB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減輕DN癥狀。

王艷等[24]為了研究UTMD聯(lián)合連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡（SMBp）對早期DN的治療效果，構(gòu)建了2型糖尿病雄性SD大鼠模型。通過對各組大鼠空腹血糖、24h尿蛋白、β2微球蛋白水平等生化指標(biāo)及AngⅡ、TGF-β1、P-選擇素、SelS 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，超聲+SMBp組大鼠上述檢測指標(biāo)均顯著低于對照組、單純 SelS組、SMBp組，治療效果均優(yōu)于上述組別。上述結(jié)果表明連接SMBp聯(lián)合UTMD治療早期DN有顯著療效，是作為防治早期DN的有效手段之一。

Ting等[25]構(gòu)建雄性SD大鼠早期DN模型，通過將CoQ10與脂質(zhì)體組裝成CoQ10-脂質(zhì)體（CoQ10-lip），并利用UTMD技術(shù)對早期DN模型大鼠進(jìn)行治療，同時評價模型大鼠腎臟的形態(tài)和功能。實驗結(jié)果表明，經(jīng)CoQ10-lip聯(lián)合UTMD治療后，大鼠腎血流動力學(xué)明顯改善，其中24h尿蛋白降低、氧化應(yīng)激指標(biāo)相應(yīng)調(diào)節(jié)提示腎功能恢復(fù)。由此可見，CoQ10-lip和超聲微泡的結(jié)合對受損腎臟的保護(hù)效果也優(yōu)于其他對比組。這也提示CoQ10-lip聯(lián)合UTMD對于逆轉(zhuǎn)早期DN的可行性。

綜上所述，UTMD技術(shù)聯(lián)合基因治療為DN治療的臨床開展提供了充分的可能性，也為DN的基因治療盡早應(yīng)用于臨床打下堅實基礎(chǔ)，更為廣大糖尿病患者早日克服DN困擾帶來福音。

4 問題與展望

UTMD介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運在DN的基因治療中扮演重要角色，動物水平已證明其可以提高基因在DN腎臟中的轉(zhuǎn)染效率，能滿足作為非病毒基因載體的生物學(xué)特性需求。但DN基因治療在運用于臨床前仍有許多問題等待解決，例如：（1）如何尋找有效的DN靶向基因以及調(diào)控DN發(fā)生、發(fā)展的信號通路，并以此尋找針對性治療方案；（2）如何增加超聲微泡的載藥率及運輸途中的損失率；（3）如何降低靶向爆破超聲微泡所引起的組織出血、血管內(nèi)溶血，熱效應(yīng)以及組織損傷等不良反應(yīng)。

總之，基因治療有潛力成為一種對抗DN的有效武器，而UTMD技術(shù)介導(dǎo)的靶向基因治療具有安全、有效、無創(chuàng)且可重復(fù)性高等多種優(yōu)點，是進(jìn)一步促進(jìn)DN基因治療早日應(yīng)用于臨床的強(qiáng)有力輔助手段。