趙林平，余細(xì)勇

(廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436)

近年來，干細(xì)胞治療為許多難治之癥帶來了希望，干細(xì)胞移植在治療心肌梗死[1]、阿爾茨海默病[2]等疾病方面成效明顯。但是對(duì)于干細(xì)胞體外培養(yǎng)仍面臨以下問題：(1) 在培養(yǎng)過程中，干細(xì)胞易凋亡和分化；(2) 在一定的培養(yǎng)條件下，很難對(duì)細(xì)胞應(yīng)力進(jìn)行檢測(cè)；細(xì)胞微環(huán)境(stem cells niche)也稱干細(xì)胞龕，是機(jī)體組織儲(chǔ)存干細(xì)胞的位置，是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境。干細(xì)胞微環(huán)境主要包括細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、力學(xué)信號(hào)等。力學(xué)刺激的產(chǎn)生主要有兩個(gè)途徑：內(nèi)源性力學(xué)信號(hào)和外源性力學(xué)信號(hào)。內(nèi)源性力學(xué)信號(hào)是通過細(xì)胞骨架蛋白的重組，以及肌動(dòng)球蛋白的收縮，作用于細(xì)胞外基質(zhì)以及基質(zhì)細(xì)胞。外源性力學(xué)信號(hào)是通過機(jī)體的物理運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生機(jī)械拉伸、剪切、收縮等刺激引起細(xì)胞效應(yīng)[3]。因?yàn)闄C(jī)械刺激對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控至關(guān)重要，所以就如何在體外模擬體內(nèi)相適應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)力模型成為了研究熱點(diǎn)。本文主要綜述微環(huán)境中力學(xué)信號(hào)對(duì)干細(xì)胞A型核纖層蛋白(Lamin A/C)的調(diào)節(jié)，以及Lamin A/C的功能變化對(duì)染色體修飾、基因表達(dá)調(diào)控的影響。

1 核纖層蛋白的結(jié)構(gòu)特征

核纖層由A型核纖層蛋白及B型核纖層蛋白共同組成，處于內(nèi)核膜與染色質(zhì)之間，起著維持細(xì)胞核的形態(tài)、保護(hù)染色質(zhì)，以及與核纖層連接蛋白共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、衰老等作用(Tab 1)。B型核纖層蛋白包括Lamin B1、Lamin B2、Lamin B3，分別由LMNB1和LMNB2編碼。A型核纖層蛋白分為L(zhǎng)amin A(72 ku)和Lamin C(65 ku)，是由同一個(gè)基因LMNA轉(zhuǎn)錄、翻譯而來。不同的是，Lamin A與Lamin C 在碳末端有著不同的氨基酸序列，并且Lamin A是由前體PrelaminA(74 ku)經(jīng)剪切修飾而來。在有絲分裂期間，A型Lamins溶解，并在有絲分裂中期游離于核漿內(nèi)，法尼基化B型Lamins則仍保留在核膜上。哺乳動(dòng)物一般表達(dá)B型Lamins，而A型Lamins則主要表達(dá)于除胚胎干細(xì)胞之外的所有細(xì)胞中[4]。

Tab 1 Lamin-associated proteins and function

2 力學(xué)刺激對(duì)Lamin A/C的調(diào)控

A型Lamins的表達(dá)量與組織器官的硬度呈正相關(guān)，隨著組織器官硬度增加，Lamin A/C的表達(dá)量也隨之增加，具體表現(xiàn)為股骨表達(dá)量最高，軟骨組織其次，最少的為大腦組織[5]。細(xì)胞也是如此，Lamin A/C在胚胎干細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[4]。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、人造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、心肌細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)量高[11]，故細(xì)胞微環(huán)境對(duì)Lamin A/C的調(diào)節(jié)作用。Lamin A/C維持細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定的同時(shí)，參與細(xì)胞外應(yīng)力刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。Swift等[11]首次發(fā)現(xiàn)，Lamin A/C參與力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及其機(jī)制。將MSCs接種于0.3 kPa與40 kPa的聚丙烯酰胺基底的培養(yǎng)皿上，發(fā)現(xiàn)40 kPa組MSCs的Lamin A/C、myosin-IIA表達(dá)量明顯高于0.3 kPa組，且Lamin A/C磷酸化水平較0.3 kPa組明顯降低，并闡明力學(xué)刺激調(diào)控Lamin A/C表達(dá)的機(jī)制，表現(xiàn)為L(zhǎng)amin A/C蛋白通過維甲酸信號(hào)通路，調(diào)控LMNA的轉(zhuǎn)錄，myosin-IIA通過血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)信號(hào)通路調(diào)控MYH9轉(zhuǎn)錄。在硬度較大的培養(yǎng)皿中，myosin-IIA磷酸化降低，并通過myosin-IIA的收縮緊張，同時(shí)調(diào)控著Lamin A/C的磷酸化和LMNA的轉(zhuǎn)錄。

3 Lamin A/C功能變化與染色體修飾

在細(xì)胞核邊緣，常染色體和異染色質(zhì)通過纖層蛋白連接區(qū)域(Lamins-associated domain, LADs)與Lamin A/C相連，Lamin A/C功能的變化影響細(xì)胞表觀遺傳的標(biāo)志。

3.1LaminA/C功能改變與組蛋白甲基化研究表明，LMNA基因突變影響著染色質(zhì)在核內(nèi)的定位與分布。在LaminA(LAΔ50)突變的細(xì)胞，細(xì)胞核邊緣異染色質(zhì)明顯減少，通過檢測(cè)異染色質(zhì)的標(biāo)志發(fā)現(xiàn)，H3K27me3及EZH2下調(diào)，并伴隨著結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的標(biāo)志H4K20me3的上調(diào)[12]。同樣，Gesson等[7]實(shí)驗(yàn)證明，在小鼠Tmpo WT和KO的細(xì)胞中，Lamin A/C結(jié)合常染色質(zhì)區(qū)域抑制轉(zhuǎn)錄(H3K9me3、H3K27me3)和激活轉(zhuǎn)錄(H3K4me3、H3K9ac)的組蛋白標(biāo)記增多，而未結(jié)合區(qū)域則相應(yīng)減少，卻不影響總體基因表達(dá)。相比于異染色質(zhì)，結(jié)合與未結(jié)合區(qū)域表觀遺傳的標(biāo)記卻未改變，而未結(jié)合區(qū)域基因表達(dá)卻上升。表明Lamin A/C以及Lamin A/C-Lap2α復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)扮演著表觀遺傳調(diào)控的角色。

3.2LaminA/C功能變化與組蛋白乙?；疞aminA同樣影響著組蛋白乙?；珺arateau等[13]在先天性肌營(yíng)養(yǎng)不養(yǎng)的患者細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LMNA的新突變位點(diǎn)R388P，并將該突變基因轉(zhuǎn)染至C2C12成肌細(xì)胞中，可引起組蛋白H3K9乙酰化。已證實(shí)SIRT1影響著干細(xì)胞衰老[14]，Liu等[15]進(jìn)一步研究證明，在細(xì)胞內(nèi)LaminA與SIRT1直接連接，且LaminA是激活SIRT1去乙酰化作用所必需的。在早老病患者(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)的細(xì)胞中，大量的LaminA被早老蛋白(progerin)替代，SIRT1失去對(duì)p53的去乙?；饔?，從而引起細(xì)胞衰老。

4 Lamin A/C功能變化與基因表達(dá)

LMNA基因突變可引起早老病、擴(kuò)張型心肌病、埃-德二氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，ED-MD)等疾病，而目前研究尚未發(fā)現(xiàn)B型Lamins突變引起的疾病。早老病是一種致命的人類疾病，患者主要表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化和血管平滑肌細(xì)胞功能的異常。研究獲取早老病患者(LMNA在Gly608Gly位置突變)的成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞核畸形、Lamin B、Lap2β、異染色質(zhì)的標(biāo)記H3K9me3、HP1α及HDAC1都發(fā)生相應(yīng)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖的標(biāo)記Ki67也發(fā)生下調(diào)。并且將成纖維細(xì)胞用OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC重編程為HGPS-iPSC后，與BJ-iPSC(野生型)對(duì)比，在常染色體上有33個(gè)基因發(fā)生不同的甲基化，但不引起細(xì)胞功能改變。然而，將BJ-iPSC、HGPS-iPSC分別誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)時(shí)，HGPS-iPSC來源的SMCs表現(xiàn)為衰老相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞早老[16]。Cohen等[17]利用lmna-/-小鼠研究lmna-/-肌成細(xì)胞與野生型肌成細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)240種蛋白有明顯差異，包括SUN2、Smad2、Smad3、MyoD等，并且肌成細(xì)胞的增殖及分化為肌細(xì)胞的能力明顯低于正常細(xì)胞。

5 Lamin A/C對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控

5.1LaminA/C對(duì)干細(xì)胞增殖的影響Lamin A/C對(duì)干細(xì)胞增殖的影響是通過直接調(diào)控pRB的表達(dá)，并與pRB直接連接，以及通過Lap2α連接pRB抑制其降解，pRB結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子并降低其轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制細(xì)胞增殖[9]。

5.2LaminA/C對(duì)干細(xì)胞分化的影響干細(xì)胞具有很強(qiáng)自我復(fù)制的能力，并且在一定條件下能分化為多種細(xì)胞，然而使干細(xì)胞定向分化并用于臨床治療的方法有限。近年來關(guān)于細(xì)胞力學(xué)調(diào)控干細(xì)胞分化的研究逐漸增多。Bergqvist 等[10]發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)蛋白Samp1的表達(dá)在iPSCs分化過程中伴隨Lamin A/C的表達(dá)而迅速上調(diào)，并與Lamin A/C、emerin相互作用，調(diào)節(jié)iPSCs的分化。Swift等[11]研究證明，在柔軟環(huán)境中，MSCs趨于向脂肪細(xì)胞分化，并且證明敲低Lamin A/C能促進(jìn)向脂肪細(xì)胞的分化，而在硬度較大的培養(yǎng)皿中，MSCs則向成骨細(xì)胞分化。緊隨其后，Shin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Lamins蛋白水平影響著造血干細(xì)胞的分化，通過高表達(dá)LaminA、敲低LaminA的表達(dá)或加入維甲酸受體抑制劑調(diào)控造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞的分化。

5.3LaminA/C與干細(xì)胞衰老早老綜合征患者一般是LMNA基因在Gly608Gly位置的突變，導(dǎo)致早老蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而影響細(xì)胞力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、重要信號(hào)通路的傳導(dǎo)和基因的穩(wěn)定性等，進(jìn)而引起干細(xì)胞衰老。Lavasani等[19]研究證明，早老蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累影響干細(xì)胞的增殖分化，并發(fā)現(xiàn)WT肌來源干細(xì)胞與HGPS干細(xì)胞共培養(yǎng)能修復(fù)HGPS干細(xì)胞的功能，并通過腹腔注射WT肌來源干細(xì)胞延長(zhǎng)早老綜合征小鼠的壽命。目前，主要運(yùn)用HGPS多潛能干細(xì)胞模型來研究衰老，尋找藥物作用靶點(diǎn)治療早老綜合征[16]。

6 Lamin A/C的細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

細(xì)胞骨架不僅承擔(dān)著保護(hù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、遺傳物質(zhì)不被物理運(yùn)動(dòng)破壞的重要作用，而且還扮演著力學(xué)感受器的角色。細(xì)胞骨架主要由肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞骨架連接蛋白、纖層蛋白等構(gòu)成，當(dāng)機(jī)械刺激作用于細(xì)胞膜上的整合素受體，使其活化內(nèi)吞，激活下游通路中的黏著斑激酶(FAK)，或者通過ECM-integrins-talin-actin通路，使YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位或者由myosin-IIA緊張拉伸將力學(xué)信號(hào)傳遞至核膜上，再由Nesprins-SUNs-Lamin A/C復(fù)合物傳導(dǎo)至核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)[11,20-21]。Lamin A/C在這過程中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LMNA基因突變的肌前體細(xì)胞，其胞質(zhì)骨架蛋白與細(xì)胞核骨架蛋白非正常連接，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的張力與ECM的張力不一致[22]。

7 靶向Lamin A/C的藥物研究進(jìn)展

伴隨著細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的研究，涌現(xiàn)出了大批的表觀遺傳學(xué)藥物[23]，而針對(duì)干細(xì)胞Lamin A/C作為藥物靶點(diǎn)的研究較少。目前，絕大多數(shù)藥物研究集中于治療LMNA突變引起的早老病、擴(kuò)張型心肌病、EDMD等。2014年，Larrieu等[24]發(fā)現(xiàn)小分子化合物Remodelin能通過抑制NAT10，達(dá)到改善LMNA突變引起的細(xì)胞核畸形、染色質(zhì)松散、DNA損傷。2016年，Egesipe等[25]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能降低HGPS-MSCs中早老蛋白的沉積，進(jìn)而恢復(fù)HGPS-MSCs的功能。

8 問題與展望

作為微環(huán)境中的組成部分，力學(xué)信號(hào)調(diào)控著干細(xì)胞命運(yùn)，并逐漸被人們重視。然而仍存在著一些問題：首先，機(jī)械刺激誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化的機(jī)制仍不清晰；其次，細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)存在的Lamin A/C是否參與力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和參與細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控？最后，LaminA、LaminC 在參與干細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控的過程中是否行使著不同的功能？隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，相信這些問題都會(huì)被闡明，干細(xì)胞的臨床治療和研究將迎來新紀(jì)元。