尹玉潔，張 倩，曠湘楠，賈振華

(1. 河北中醫(yī)學院, 研究生學院, 河北 石家莊 050090；2. 河北以嶺醫(yī)藥研究院, 河北 石家莊 050035；3. 河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院心血管病科, 河北 石家莊 050091)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的終點站，被世界心臟病學家Braunwald教授喻為“心臟病最后的大戰(zhàn)場”。心肌纖維化(myocardiac fibrosis, MF)作為多種CVD終末期的共同病理表現(xiàn)，隨著人類對器官纖維化細胞和分子機制的深入探索，已明確肌成纖維細胞是參與纖維化的主要效應細胞，但對其來源仍存在爭議。近來研究表明，內(nèi)皮-間質(zhì)轉分化(endothelial mesenchymal transition, EndMT)在組織纖維化、損傷后修復及腫瘤病程中發(fā)揮重要作用[1]，明確EndMT在MF中的作用機制將為CVD的防治提供新的干預靶點和理論依據(jù)。

1 MF在CHF病程進展發(fā)揮至關重要的作用

CHF是各種致病因素導致心肌結構改變、舒縮功能障礙，心排血量不足以維持組織代謝需要的病理狀態(tài)，是一個多因素相互作用的復雜病理過程。現(xiàn)代醫(yī)學對于CHF的認識經(jīng)歷了從器官到細胞，再到基因的過程，從20世紀40年代的體液潴留機制，到20世紀60年代的泵功能障礙機制，直至20世紀80年代開始重視神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子系統(tǒng)的過度激活。近期研究表明，心臟病理性重構、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活是慢性心衰病程進展的關鍵因素，其治療思路和模式已取得長足進展。心臟重構由包括心肌細胞、心臟成纖維細胞和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)參與，通過一系列復雜的細胞和分子途徑激活所誘導，是多種心血管系統(tǒng)疾病終末期的共同病理表現(xiàn)。而MF與心臟重構有著本質(zhì)的聯(lián)系，其主要病理過程是促進和激活心肌成纖維細胞，促進ECM的過度積累[2]，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的沉積以及ECM的交聯(lián)，共同增加室壁硬化、降低心功能，是各種心臟疾病的最常見必經(jīng)途徑，包括心肌梗死、缺血/再灌注損傷[3]、肥大型心肌病、糖尿病性心肌病和心力衰竭[4]，因此預防和逆轉MF具有重要意義。雖然MF的病理生理機制已經(jīng)被廣泛揭示，但由于其復雜的病因學，許多介入靶點的作用有限，所以仍無有效的干預方法。因此，明確MF的作用機制和干預靶點，可為CHF的防治提供理論依據(jù)。

2 EndMT是防治MF的關鍵病理環(huán)節(jié)

MF的物質(zhì)基礎是ECM，主要源于心臟成纖維細胞，它可以迅速感知ECM硬度，并誘導ECM調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)表達，增加膠原沉積，從而導致MF。Kassem等[5]認為，心臟纖維化的主要介導細胞是(肌)成纖維細胞，心肌成纖維細胞來源于成纖維細胞、骨髓源性纖維細胞，以及上皮細胞的間質(zhì)轉分化( epithelial-mesenchymal transition，EMT) 和EndMT[6]。

EMT即上皮細胞失去黏附連接和極化，向間質(zhì)細胞轉化，是參與組織纖維化形成、損傷后修復和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要過程[7]。EndMT則被認為是EMT的一種亞型，在生理狀態(tài)下，心臟胚胎發(fā)育期間，來自心內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞(endothelial cells, ECs)可以通過EndMT來增加心臟瓣膜和心臟的隔膜[8]。在病理狀況下，EndMT參與許多心血管系統(tǒng)及組織纖維化疾病，如急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)[9]、心力衰竭、高血壓、肺動脈高壓[10]、系統(tǒng)性硬化癥、單側輸尿管梗阻等。Zeisberg等[6]研究發(fā)現(xiàn)，EndMT 在壓力負荷和異體移植小鼠模型中參與CF的病變進程，EndMT是纖維化組織肌成纖維細胞的重要來源之一[11]。ECs通過EndMT過程轉變?yōu)槌衫w維細胞，并分泌ECM蛋白，其病理性積累可造成心臟纖維化，導致心室功能失調(diào)，心臟微循環(huán)受阻，甚至破壞正常心肌結構，造成心室重構，心臟纖維化組織中大約27%～35%成纖維細胞是來源于EndMT。外源性和內(nèi)源性轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)的升高是EndMT的有效誘導劑，當拮抗TGF-β時，其EndMT以及心臟纖維化程度均能明顯降低，緩解心室重構程度。Martinez等[12]研究發(fā)現(xiàn)，由于EndMT微血管內(nèi)皮細胞減少，使毛細血管密度變小，導致慢性缺氧，從而促進間質(zhì)成纖維細胞的TGF-β表達，促進炎癥細胞聚集，加劇纖維化過程，致使慢性心衰進一步惡化。提示EndMT可能是防治CHF、阻抑MF的重要靶點，但EndMT明確的分子機制尚未完全闡明。

2.1EndMT概述及轉錄因子ECs構成血管和淋巴管的內(nèi)膜，在解剖學上類似于鱗狀上皮，有基底極性并呈緊密連接。EndMT的特征在于ECs逐步喪失內(nèi)皮特異性標記物表達，如VE-鈣黏蛋白(VE-cadherin)、血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1 PECAM1/CD-31，并獲得間質(zhì)細胞或肌成纖維細胞表型表達，如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin, Vim)、成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和ECM蛋白如纖維連接蛋白、I型、III 型膠原。這些基因和蛋白質(zhì)表達的改變會導致ECs失去其黏附性，并刺激細胞骨架重塑，改變內(nèi)皮細胞極性，產(chǎn)生“梭形”的成纖維細胞樣的形態(tài)，具有高度的侵襲性和遷移性。

EndMT涉及的細胞黏附喪失由多種轉錄因子介導，如鋅指結合蛋白家族轉錄因子Snail1和Snail2(也稱為Slug)，鋅指E盒結合同源異型盒ZEB1、ZEB2、Twist，淋巴增強子結合因子-1(lymphoid enhancer-binding factor-1, LEF-1)等[13]，這些轉錄因子在EndMT中由TGF-β2或BMP4調(diào)控，進而抑制基因編碼蛋白的轉錄。Xu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Snail是低氧誘導人冠狀動脈EndMT的直接靶點。VE-cadherin在維持ECs細胞間緊密連接的穩(wěn)定性中起關鍵作用，Snail家族結合CDH1啟動子，編碼VE-cadherin以抑制其轉錄，促進細胞發(fā)生表型轉化。ZEB家族能夠增加MMPs基因的表達，提示ZEB家族參與EndMT相關的各種基質(zhì)重塑。LEF-1通過抑制VE-cadherin，直接誘導EndMT。反之，抑制LEF-1活性或靶向干擾小RNA，阻抑EndMT進程。轉錄因子結合到與細胞黏附相關的基因啟動子區(qū)域，并抑制其轉錄，是EndMT的關鍵起始步驟。

2.2調(diào)控EndMT的信號通路EndMT涉及的信號轉導通路主要有TGF-β/BMP信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、Hypoxia信號通路及micro RNAs等。

2.2.1TGF-β信號通路 TGF-β信號通路是誘導EndMT的關鍵因子，通過影響細胞增殖、分化、凋亡，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及修復組織損傷，同時也參與腫瘤、血管系統(tǒng)病變及多器官纖維化的病程進展。哺乳動物中，TGF-β超家族的配體包括TGF-β的3種亞型(TGF-β1、2、3)和6種BMP種亞型(BMP2-7)。已證實，TGF-β1和TGF-β2培養(yǎng)ECs刺激EndMT發(fā)生[15]。TGF-β信號與其細胞表面Ⅰ型(TGF-βRⅠ)和Ⅱ型TGF-β受體(TGF-βRⅡ) 組成異四聚體受體復合物，ECs中內(nèi)皮素siRNA基因沉默誘發(fā)TGF-β1通過β-聚糖、ALK5和磷化的Smad2/3發(fā)生級聯(lián)信號轉導反應，在調(diào)控EndMT中發(fā)揮至關重要的作用。抑制小鼠ECs中ALK5、TβRⅡ、β-聚糖或內(nèi)皮素，可阻抑胚胎EndMT。TGF-β在體內(nèi)以無活性的前體蛋白分泌，其組成物LTBP和LAP被纖維蛋白溶酶、MMP或整合素β6等裂解而激活，活化的TGF-β通過Smad依賴信號通路和Smad非依賴性信號通路，調(diào)控細胞內(nèi)復雜的信號反應。

2.2.1.1Smads依賴性信號通路 TGF-β配體與內(nèi)皮細胞膜表面TGF-βRⅡ結合后，激活Ser/Thr激酶，使TGF-βRI磷酸化，在TGF-βRⅠ的Gly/Ser(GS)富集區(qū)域產(chǎn)生對接位點，招募轉錄因子Smad蛋白家族中的受體激活型Smad2和Smad3，Smads C末端結構域的Ser殘基被磷酸化，Smad2/3與通用型Smad4形成復合物，隨后轉入細胞核，與調(diào)控因子相結合，誘導EndMT相關的關鍵基因轉錄[16]。Smads還能夠直接與Snail1啟動子結合形成復合物以誘導轉錄、抑制VE-cadherin和occludin蛋白編碼基因的表達；同時間接影響其他因素包括ZEB轉錄因子和高遷移率組因子HGMA2，調(diào)節(jié)Snail1、Snail2和TWIST表達。TGF-β信號也能激活抑制型Smad蛋白(Smad6/7)競爭性結合到TGF-βRⅠ上，以阻斷Smads招募。

2.2.1.2Smads非依賴性信號通路 除了TGF-β/Smad經(jīng)典通路之外，多條Smad非依賴性通路亦參與EndMT的調(diào)控。TGF-β能夠通過激活絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，包括ERK、JNK、p38 MAPK，以及小G蛋白(Ras、RhoA、Rac1、CDC42、mTOR)和NF-κB通路等，參與EndMT。

TGF-β能夠通過激活自身受體或反式激活EGF和PDGF受體，從而激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信號通路，誘導EndMT。Wylie-Sears等[17]進行綿羊心臟瓣膜ECs實驗研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1也可以通過促進ERK磷酸化誘導EndMT，而應用ERK磷酸化抑制劑后，EndMT效應也受到抑制。Montorfano等[18]證明，H2O2通過激活TGF-β/p38 MAPK信號通路，誘導ECs發(fā)生EndMT。

2.2.2Wnt信號通路 經(jīng)典Wnt信號通路通過核內(nèi)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的累積，激活Wnt相關靶基因。β-catenin是Wnt信號通路中最重要的效應分子，糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)是一種降解細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的激酶。在無Wnt信號時，β-catenin與GSK-3β、結直腸腺瘤息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)以及軸蛋白(Axin)結合形成“降解復合物”，使胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin 維持低水平。當穩(wěn)態(tài)打破后，Wnt蛋白與細胞膜受體Frizzled和LRP5/LRP6結合形成復合物，通過作用于胞質(zhì)內(nèi)蓬亂蛋白(Dishevelled, Dvl)，導致胞質(zhì)中“降解復合物”失去活性，從而減少β-catenin的磷酸化及降解，游離的β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)蓄積并發(fā)生核轉移，與轉錄因子T細胞因子(T-cell factor,TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancingfactor,LEF)結合，啟動TCF轉錄活性，調(diào)節(jié)靶基因的表達[19]，誘導EndMT發(fā)生。在冠脈結扎術心肌梗死小鼠模型中發(fā)現(xiàn)[20]，經(jīng)典Wnt信號通路的啟動可誘導心內(nèi)膜下ECs發(fā)生EndMT，這與其他報道中細胞核內(nèi)β-catenin蓄積引起VE-cadherin表達下降、纖維連接蛋白表達增加是一致的。在脊椎動物心室管形成研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號激活后，通過誘導房室管心肌細胞中BMP信號激活，房室管內(nèi)膜細胞發(fā)生EndMT。

2.2.3Notch信號通路 Notch信號通路調(diào)控細胞分化、增殖和凋亡等過程中，由Notch配體、Notch受體、細胞內(nèi)效應分子CSL DNA結合蛋白及靶基因組成。Notch受體作為異二聚體構成的單次跨膜受體，包括4個受體(Notch1-4)，已證實的5個Notch 配體為單次跨膜蛋白(Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)。Notch配體與跨膜受體結合后，在γ-分泌酶作用下裂解，釋放可溶性的Notch1胞內(nèi)結構域(notch intracellular domain, NICD)進入細胞核內(nèi)，NICD是Notch受體的活化形式，通過與DNα結合的CSL轉錄抑制復合物結合，調(diào)控核內(nèi)靶基因表達[21]。

Notch信號通過調(diào)節(jié)轉錄因子Snail、Snail2、ZEB1表達，參與調(diào)控EndMT。Notch與Snail2的相互作用，對于Notch介導抑制VE-cadherin和β-catenin激活是至關重要的，Notch過表達會導致ECs血管內(nèi)皮VE-cadherin減少，并隨之發(fā)生EndMT。在臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)研究中發(fā)現(xiàn)，Notch信號在TGF-β誘導的EndMT發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[22]。同樣地，在人腎小球內(nèi)皮細胞研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，且給予Notch通路拮抗劑γ分泌酶阻斷后，這種轉化效應受到抑制[20]。此外，在肺腺癌細胞中，抑制Notch1能夠降低其侵入性表型，并部分逆轉EMT[23]。

2.2.4缺氧信號通路 缺血缺氧的誘因存在于各種EndMT相關的系統(tǒng)性疾病，如纖維化和癌癥的發(fā)生過程中。低氧張力能夠改變細胞表型，與其他信號通路協(xié)同誘導EndMT發(fā)生。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶(如PHD2、PHD3)可以催化和降解缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)，而缺氧環(huán)境抑制脯氨酰羥化酶激活。HIF-1α作為一種轉錄因子，能夠直接與TWIST1啟動子的缺氧反應元件相結合，調(diào)控EndMT相關基因的表達，如TGF-β、TWIST、LOX。此外，HIF-1α可誘導間質(zhì)標記物表達，如波形蛋白、N-cadherin，N-cadherin是HDAC3介導的組蛋白甲基轉移酶復合物形成的必要條件。在HIF-1α誘導EndMT過程中，HDAC3表達增加，并結合CDH1和JUP啟動子(編碼g-catenin)，與Snail1協(xié)同抑制其轉錄。有趣的是，缺氧能夠逆轉Smad7的抑制功能，并將其轉換成細胞侵襲啟動子，表明效應蛋白的模塊化特性及其應對環(huán)境因素反應的靈活性。

2.2.5micro RNAs調(diào)控EndMT micro RNAs(miRNAs)是一類長度約為21～25個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA，通過與靶mRNA互補序列的堿基配對，觸發(fā)降解或阻止靶mRNA的翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達。miRNAs參與細胞增殖、死亡、分化等過程。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs還參與調(diào)節(jié)MF、心肌肥厚、心力衰竭、肺動脈高壓等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，并調(diào)控其中的EndMT過程。

Kumarswamy等[24]發(fā)現(xiàn)，miR-21通過調(diào)控PTEN/Akt通路，促進TGF-β誘導的HUVECs發(fā)生EndMT，敲除大鼠體內(nèi)ECs的miR-2基因，能夠通過減少膠原蛋白及纖維連接蛋白的表達，進而延緩心肌纖維化的進程。類似地，miR-20可以通過下調(diào)ALK5、TGF-βRII，抑制TGF-β誘導的HUVECs發(fā)生EndMT。進一步探索發(fā)現(xiàn)，EndMT發(fā)生過程中，miR-195、miRLet-7c、miRLet-7g的表達水平均明顯升高，而miR-122a、miR-127、miR-196、miR-375的水平明顯下降，表明micro RNAs在參與調(diào)控EndMT過程中發(fā)揮重要作用，其具體的調(diào)控機制尚有待深入研究。

2.2.6EndMT信號通路之間的交互反應 EndMT參與各種病理變化過程涉及多條信號通路，不同的信號通路及轉錄因子相互之間可能存在交叉對話，形成錯綜復雜的信號網(wǎng)絡。

TGF-β信號通過激活不同效應蛋白，與各種途徑進行交互作用。Notch和TGF-β信號在心內(nèi)膜墊形成中協(xié)同發(fā)揮作用。TGF-β作用下，促進細胞連接分解，β-catenin在細胞核中積累，通過與LEF-1形成復合物，增強信號通路。 Smad蛋白經(jīng)常連接TGF-β和其他信號級聯(lián)，如Smad蛋白與LEF-1亦可形成復合物以抑制CDH1的轉錄。 TGF-β能夠通過其自身受體直接激活，或通過EGF和PDGF受體反式激活PI3K信號通路，抑制PI3K活性可以消除EndMT，并減少Smad2的磷酸化。ATF-2(p38 MAPK通路底物)和c-Jun(JNK通路底物)能夠與Smad相互作用。此外，ERK通路涉及與TGF-β和其他生長因子之間串擾，以誘導EndMT。

信號串擾的最明顯的例子之一是通過自分泌信號和基質(zhì)重塑，產(chǎn)生正反饋循環(huán)。Snail1與MAPK下游的轉錄因子ETS1配合，激活MMP表達。MMP3的結合會增加活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和Snail1的表達，從而激活EndMT，并產(chǎn)生MMP-2和MMP-9，MMPs降解基底膜，釋放潛伏性TGF-β，且能夠優(yōu)先結合I型膠原和纖連蛋白，這些ECM蛋白激活了它們自身的細胞內(nèi)EndMT信號級聯(lián)反應。纖連蛋白的合成與Wnt活化和核β-catenin的積累也相關。

缺氧和Notch信號之間的串擾在EndMT過程中已得到證實，HIF-1α增加了LOX的表達，LOX是FAK活性和細胞間與細胞-基質(zhì)黏附所需的酶，通過使CDH1啟動子中的三甲基化組蛋白H3 Lys4脫氨基，穩(wěn)定Snail1的活性[25]。在腫瘤病程中，缺氧引起Notch信號傳導異常，并穩(wěn)定核內(nèi)NICD表達，參與誘導EndMT。

在復雜的信號通路串擾過程中，需要有效的機制整合信號來抑制EndMT的異常激活。因此，明確ECs獲得侵入性表型的過程是通過各個信號串擾的級聯(lián)過程，特別是在細胞與其動態(tài)環(huán)境之間的相互作用，對于尋找EndMT的有效干預靶點至關重要。

3 結語

近年來，有關EndMT參與各種病理變化中的作用機制研究逐漸成為熱點，參與EndMT的多種信號機制相互之間存在交叉對話，形成錯綜復雜的信號網(wǎng)絡。調(diào)控EndMT有利于抑制MF的發(fā)生，從而改善心功能，并延緩CHF的病程進展。深入研究EndMT在心血管系統(tǒng)發(fā)育，及CVD發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，明確各信號通路及轉錄分子之間的交互作用，發(fā)現(xiàn)調(diào)控EndMT信號通路的共同靶點，可為防治CVD提供新的預防和診療策略。