孫 軍，溫昌明，張保朝，暴向陽(yáng)

(1. 南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000；2. 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100850)

血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞既稱(chēng)為成血管細(xì)胞，也稱(chēng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，這類(lèi)細(xì)胞可以積極參與到損傷血管的修復(fù)活動(dòng)，其數(shù)量多少維持血管的正?；顒?dòng)[1]。EPCs能調(diào)控缺血性腦卒中疾病新生血管活動(dòng)，保證EPCs的數(shù)量對(duì)于缺血性疾病的治療是一個(gè)新的研究方向[2]。在血管氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，外周血循環(huán)中EPCs的數(shù)量影響著損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)程度，同時(shí)，損傷時(shí)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)降低EPCs的生成。減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)EPCs損傷的影響，可有利于增加EPCs數(shù)量，促進(jìn)新生血管的形成及血管內(nèi)皮的修復(fù)，最終起到腦缺血部位保護(hù)修復(fù)作用[3]。PI3K/Akt信號(hào)通路能調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、遷移、增殖等生理過(guò)程，文獻(xiàn)指出，EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中，PI3K/Akt的參與能促進(jìn)EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞，使缺血部位得到新生和修復(fù)。

槲皮素(quercetin，Que)具有擴(kuò)張血管降血壓、防治冠心病、防治心肌缺血/再灌注損傷、抗血栓形成等多種功效，除此以外，Que還具有抗氧化的生物學(xué)活性，從而發(fā)揮對(duì)腦血管缺血病灶的修復(fù)和保護(hù)。研究也表明，Que能促進(jìn)EPCs的增殖，但具體的機(jī)制尚未明確[4]。本文擬通過(guò)研究Que對(duì)氧化應(yīng)激損傷EPCs的修復(fù)作用，探討Que調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)損傷部位的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Que購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，純度大于98%，以0.2 mmol·L-1溶于DMSO中；人纖連蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)，均購(gòu)于Sigma公司；DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白 (DiI-ac-LDL)購(gòu)于Abcam公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；p-Akt、Akt、β-actin及二抗，均購(gòu)自Abcam公司；WST-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天；cDNA， InvitrogenTM合成試劑盒、SYBR Green qPCR SuperMix(Thermo公司)。

1.1.2儀器 酶標(biāo)儀、凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LightCycler 480 System RT-PCR(Roche公司)。

1.2EPCs的分離及培養(yǎng)取自南陽(yáng)市中心醫(yī)院健康分娩新生兒的臍血(每份60 mL)，已得到新生兒母親的同意用于科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)在南陽(yáng)市中心醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心方法進(jìn)行分離，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)接種于用人纖連蛋白包被的培養(yǎng)板上，加入一定量的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d，用緩沖液洗掉非貼壁細(xì)胞，M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至d 7時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3EPCs的鑒定EPCs在培養(yǎng)至d 7后，直接放在倒置相差顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)特征是否符合EPCs的特點(diǎn)。并利用染料DiI-ac-LDL與FITC-UEA-1進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下鑒定并拍照。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及WST-1法篩選合適的Que實(shí)驗(yàn)濃度分離接種后的細(xì)胞培養(yǎng)至d 7后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×109·L-1，每孔吸取2 mL均勻接種于6孔板，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞)、Que組(分別加入0、30、60、90、120 μmol·L-1Que預(yù)處理30 min，加入500 μmol·L-1H2O2再處理8 h)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，用WST-1法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組4個(gè)濃度Que對(duì)EPCs增殖的影響，24 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入WST-1溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后把96孔板置于搖床上搖動(dòng)1 min，充分混勻在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞活力=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)×100%。

1.5EPCs不同時(shí)段增殖情況將培養(yǎng)好的EPCs以2×103個(gè)均勻接種至96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，用M199培養(yǎng)液(不含血清)培養(yǎng)24 h，使每孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況一致。按分組再加入各種干預(yù)因素，根據(jù)WST-1結(jié)果篩選出兩個(gè)濃度，Que實(shí)驗(yàn)組(60、90 μmol·L-1)分別加入60、90 μmol·L-1Que預(yù)處理30 min，再加入500 μmol·L-1H2O2處理8 h，期間每隔24 h換液1次，并按分組加入干預(yù)物質(zhì)。培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔分別加入10 μL WST-1溶液孵育2 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，測(cè)定OD值。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)。

1.6Westernblot檢測(cè)Akt和磷酸化Akt蛋白的表達(dá)培養(yǎng)的細(xì)胞棄培養(yǎng)液，用PBS進(jìn)行沖洗，加入裂解液15 min，刮下細(xì)胞進(jìn)行超聲和離心，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)至等濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，而后將膜封閉1 h，加入小鼠抗人Akt、磷酸化Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)，于4 ℃條件下輕搖過(guò)夜，d 2用TBST漂洗3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫輕搖2 h，再用TBST漂洗3次，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光和顯影，用Image J軟件分析蛋白相對(duì)量。

1.7qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、AKT3mRNA的表達(dá)用TRIzol法提取各組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，按cDNA合成試劑盒操作說(shuō)明步驟進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置反應(yīng)條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。引物序列見(jiàn)Tab 1，由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。逆轉(zhuǎn)錄后，檢測(cè)RNA純度，并取適量逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果采用ABI7500SDS 軟件中的Relative Quantification (ddCt) Study分析PI3K、AKT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Prime sequence and PCR product length

2 結(jié)果

2.1EPCs的鑒定如Fig 1所示，剛分離得到的單核細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，胞體折光性好，為光亮透明的狀態(tài)。培養(yǎng)7 d后，顯微鏡觀察細(xì)胞體積增大，大多細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)呈集落樣，并有一定的方向性，形態(tài)鑒定即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。培養(yǎng)7 d后的貼壁細(xì)胞，用Dil-ac-LDL和 FITC-UEA-1熒光染料處理后，在激光共聚焦顯微鏡下，雙染色熒光黃陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的 EPCs。

Fig 1 DiI-ac-LDL and FITC-UEA-1

2.2Que對(duì)EPCs的影響如Fig 2所示，Que在0～90 μmol·L-1范圍內(nèi)，無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，但30 μmol·L-1Que對(duì)EPCs增殖無(wú)任何作用。根據(jù)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇60、90 μmol·L-1Que進(jìn)行干預(yù)。

Fig 2 Effect of different concentrations of Que

**P<0.01vscontrol group

2.3Que對(duì)EPCs增殖的影響如Tab 2所示，在氧化應(yīng)激條件下，與空白對(duì)照組比較， H2O2組EPCs增殖能力明顯降低(P<0.01)，加入60、90 μmol·L-1的Que處理后，H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細(xì)胞增殖能力有明顯改善，與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Tab 2 Effects of quercetin on EPCs proliferation at different

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

2.4Que對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)ECPs中Akt和p-Akt表達(dá)的影響Fig 3、Tab 3、Tab 4結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H2O2處理后的模型組各時(shí)間點(diǎn)Akt及磷酸化Akt表達(dá)明顯下降。與H2O2模型組比較，加入Que 60、90 μmol·L-1從24 h開(kāi)始，Akt和磷酸化Akt表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5Que對(duì)EPCsPI3K、AKT3mRNA表達(dá)的影響如Tab 5、6 所示，與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組細(xì)胞中PI3K、AKT3 mRNA 水平明顯下降；與H2O2模型組比較，Que(60、90 μmol·L-1)干預(yù)后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PI3K mRNA水平明顯升高；Que(60、90 μmol·L-1)干預(yù)后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn) AKT3 mRNA水平較 H2O2模型組明顯上升(P<0.01，P<0.05) 。

Fig 3 Western blot analysis of Akt and p-Akt after 24 h

Tab 3 Expression of Akt after each period

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsH2O2

Tab 4 Expression of p-Akt after each cell culture period

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsH2O2

3 討論

EPCs能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，其分化可以使血管重生和重新內(nèi)皮化作用，其生理過(guò)程能在血管內(nèi)壁修復(fù)損傷、新生血管、改善腫瘤病理等方面有多樣的應(yīng)用前景。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，EPCs一開(kāi)始來(lái)源于骨髓，能釋放至外周血中進(jìn)行生理活動(dòng)，并在條件和環(huán)境的變化中分化成內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行血管的新生和內(nèi)皮破損地方修復(fù)，在各病理和組織工程學(xué)領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用[5-6]。由于EPCs對(duì)于血管的功能的重要性，因此對(duì)作用機(jī)制及其影響因素進(jìn)行探討顯得尤為重要，作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞能夠定位到受損的血管壁的新生內(nèi)膜中，成功分化為有修復(fù)功能的內(nèi)皮細(xì)胞。氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠削弱EPCs的增殖、分化、黏附、遷移能力，其受損后的氧化代謝物能進(jìn)一步加速EPCs的凋亡[7]。腦血管病是一種腦部動(dòng)脈或支配腦的頸部動(dòng)脈受損的疾病，極易導(dǎo)致顱內(nèi)血液流動(dòng)發(fā)生障礙，氧化應(yīng)激過(guò)度產(chǎn)生的活性氧代謝物質(zhì)，能造成缺血/再灌注氧化應(yīng)激血管再度損傷，因此，從氧化應(yīng)激角度保護(hù)EPCs是一項(xiàng)重要的課題[8]。H2O2能產(chǎn)生大量氧自由基，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，是建立細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)模型常用試劑之一。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H2O2培養(yǎng)8 h后，EPCs的增殖能力降低且活性低，多數(shù)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，證實(shí)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的存在，在此模型上，研究Que對(duì)于氧化應(yīng)激病理過(guò)程中EPCs的修復(fù)作用是如何進(jìn)行的。

Tab 5 Effects of PI3K mRNA levels after cell culture

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

Tab 6 Effects of AKT3 mRNA levels after cell culture

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

文獻(xiàn)報(bào)道，EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)有研究顯示，高密度脂蛋白可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促使血管EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)一氧化氮合酶生產(chǎn)，促進(jìn)EPCs的增殖和分化[9]。這些研究結(jié)果均闡明，PI3K/Akt能作為促進(jìn)EPCs增殖、分化的重要因素。Akt是位于PI3K下游的靶蛋白，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的蛋白激酶，也是PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的中心環(huán)節(jié)影響蛋白，調(diào)節(jié)EPCs的代謝、生長(zhǎng)、遷移及增殖過(guò)程。Akt的持續(xù)激活是EPCs生存增殖分化和抑制細(xì)胞凋亡功能的重要步驟。當(dāng)膜外刺激信號(hào)激活PI3K蛋白后，其與Akt的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)合，使其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞膜上，通過(guò)磷酸化多個(gè)底物蛋白，調(diào)節(jié)EPCs的分裂增殖、分化和存活[10]。本研究表明，模型組氧化應(yīng)激模型下，內(nèi)皮祖細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)明顯下降，PI3K、AKT3 mRNA明顯下降，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)能影響PI3K/Akt信號(hào)，對(duì)細(xì)胞的增殖分化形成阻礙作用，使EPCs的增殖減弱，細(xì)胞凋亡量增加。

Que是一種黃酮類(lèi)化合物，對(duì)其功效研究日益增多，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，Que具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗黏附、免疫調(diào)節(jié)等功效，這些功效對(duì)于血管修復(fù)可以起到作用，使其在心血管疾病的防治修復(fù)方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。相關(guān)研究證實(shí)，Que能有效對(duì)抗氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，該功能對(duì)于保持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能完整性和病理狀態(tài)修復(fù)性都是有幫助的，能夠有效減輕內(nèi)皮細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激后的各種不良反應(yīng)[11-12]。但是對(duì)于其如何作用于處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的EPCs，機(jī)制尚未明確，本研究從氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路入手，研究Que具體抗血管EPCs氧化應(yīng)激下細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組對(duì)比，經(jīng)過(guò)氧化氫處理的EPCs增殖能力明顯降低，且通過(guò)檢測(cè)磷酸化Akt、PI3K和AKT3的含量，從PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑了解氧化應(yīng)激對(duì)于EPCs的作用點(diǎn)。加入60、90 μmol·L-1Que處理12、24、48 h后，損傷的EPCs細(xì)胞增殖能力明顯增加，與模型組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，明顯升高EPCs磷酸化Akt蛋白的表達(dá)，以及PI3K、AKT3 mRNA表達(dá)。Que發(fā)揮修復(fù)EPCs的作用與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt表達(dá)水平有明顯的相關(guān)性，推測(cè)Que很可能是通過(guò)直接激活氧化應(yīng)激下的EPCs下游的PI3K/Akt信號(hào)通路，來(lái)影響EPCs的各種生物學(xué)行為。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將研究Que對(duì)于PI3K/Akt信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)，深入探討Que對(duì)氧化應(yīng)激血管的修復(fù)機(jī)制。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在南陽(yáng)市中心醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組成員的支持和協(xié)助。)