郭思言, 丁 濤, 殷 耀, 張曉燕, 柳 菡, 沈偉健,林 宏, 吳 斌, 鄧曉軍, 伊雄海, 楊功俊

(1. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019; 2. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 211198;3. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 上海 200135)

我國是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)國之一,國內(nèi)市場供應(yīng)豐富,國人對于水產(chǎn)品的需求也呈增長趨勢[1,2],水產(chǎn)品的安全性因此成為食品領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[3]。此前,原國家食品藥品監(jiān)督管理總局在2017年兩次對全國經(jīng)營環(huán)節(jié)重點(diǎn)水產(chǎn)品進(jìn)行專項(xiàng)檢查和抽樣檢驗(yàn),檢出孔雀石綠、硝基呋喃代謝物、氯霉素和喹諾酮類等藥物殘留,不合格率達(dá)到9.5%～10.9%[4,5]。已有科學(xué)工作者就致病微生物、病毒、養(yǎng)殖與加工過程中漁藥的非法投入、甲醛及重金屬等不同危害來源進(jìn)行了水產(chǎn)品領(lǐng)域的風(fēng)險監(jiān)測[6],但國內(nèi)對水產(chǎn)品中其他品種環(huán)境污染物監(jiān)測覆蓋率不高。污染物通常指農(nóng)藥類、持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)和藥物及個人護(hù)理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)等,主要由周圍環(huán)境帶入,因具有復(fù)雜和不確定性使水產(chǎn)品質(zhì)量安全受到的威脅難以預(yù)測[7-9]。高分辨質(zhì)譜因其掃描范圍寬,測定靈敏度高,結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫可實(shí)現(xiàn)對未知化合物的定性被廣泛用于非定向篩查分析[10,11]。四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜作為高分辨質(zhì)譜的一種,分辨率可達(dá)十萬,在無標(biāo)準(zhǔn)品及短時間內(nèi)無法對分析物進(jìn)行條件優(yōu)化的情況下,通過準(zhǔn)確測定分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)、化合物同位素豐度比及二級碎片特征離子信息與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫檢索匹配,實(shí)現(xiàn)大量數(shù)據(jù)的高通量分析,從而完成對樣品中藥物殘留的定性篩查[12]。因此,選擇高靈敏度、高準(zhǔn)確性的高分辨質(zhì)譜對水產(chǎn)品中含量較低的環(huán)境污染物進(jìn)行非定向篩查分析較為合適。國外有相關(guān)研究證明水產(chǎn)品中已檢測到多溴聯(lián)苯、多氯聯(lián)苯及有機(jī)氯農(nóng)藥在魚體內(nèi)的聚集[13], Chiesa等[14]利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究并測定了野生金槍魚中持久性污染物的含量,發(fā)現(xiàn)部分金槍魚中含有POPs,雖然沒有明確的毒性,但經(jīng)過長時間生物積累,有可能會大量聚集在生物體中,對食品安全造成威脅。Nacher-Mestre等[15]利用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)毒死蜱、嘧啶磷在一些植物性飼料中檢出,而乙氧基喹啉在動物飼料和魚中檢出,但作者未對其含量進(jìn)行測定。

本研究利用靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜,通過采集樣品全息離子掃描-數(shù)據(jù)依賴二級離子掃描數(shù)據(jù)圖,結(jié)合含有1 729種環(huán)境污染物的數(shù)據(jù)庫對405個水產(chǎn)樣品中的環(huán)境污染物殘留進(jìn)行高通量非定向篩查分析,樣品中除篩查出孔雀石綠、硝基呋喃代謝物、氯霉素和喹諾酮類等藥物殘留外,對未在我國水產(chǎn)品中要求相關(guān)限量的污染物三環(huán)唑、乙氧基喹啉和咖啡因進(jìn)一步優(yōu)化其樣品前處理?xiàng)l件,并進(jìn)行定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、試劑、材料和樣品

三環(huán)唑(tricyclazole)、乙氧基喹啉(ethoxyquin)、嗎菌靈(dodemorph)、氯吡脲(forchlorfenuron)、高滅磷(acephate)、二丙烯草胺(allidochlor)、噻嗪酮(buprofezin)、卡巴呋喃(cabofuran)、綠麥隆(chlortoluron)、二苯胺(diphenylamine)購自Sigma公司,純度≥95%;咖啡因(caffeine)、速滅威(metolcarb)購自Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95%。乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;甲酸(色譜純)購自美國Tedia公司;無水硫酸鎂(分析純)購自南京化學(xué)試劑一廠;十八烷基硅烷粉(C18, 40～60目)和N-丙基乙二胺粉(primary secondary amine, PSA, 40～60目)購自美國Sepax-UCT公司;氯化鈉(分析純)購自南京化學(xué)試劑股份有限公司;石墨化炭黑(Carb-GCB)購自深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司;Envi-Carb串聯(lián)PSA柱(500 mg/500 mg/6 mL)購自美國Supelco公司;水產(chǎn)樣品來自江蘇省水產(chǎn)批發(fā)和零售市場。

標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配制成1 000 mg/L母液,4 ℃冰箱避光保存。根據(jù)實(shí)際需要稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器設(shè)備

Dionex 3000高壓液相色譜、Thermo Scientific Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀帶Trace Finder處理軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司); ELGA-Q15高純水發(fā)生器(英國ELGA公司);渦旋混合器(北京來普特科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1篩查分析通用前處理

稱取5 g(精確到0.01 g)水產(chǎn)樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻3 min,超聲提取10 min,在8 000 r/min下離心3 min,取上清液于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL甲醇-水(3∶7, v/v)渦旋30 s,過0.22 μm濾膜后供儀器分析。

1.3.2定量分析前處理

稱取2 g(精確到0.01 g)水產(chǎn)樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈、4 g無水硫酸鎂、10 g氯化鈉置于渦旋混合器渦旋5 min,使樣品充分鹽析,超聲提取10 min, 8 000 r/min下離心3 min,轉(zhuǎn)移上清液至10 mL試管中,于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。加?.5 mL甲醇渦旋混勻,溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,加入水0.5 mL、PSA 50 mg、C1820 mg,以12 000 r/min離心3 min,過0.22 μm濾膜后供儀器分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);流動相A為甲醇,流動相B為0.1%(v/v)甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～3.0 min, 10%A～40%A; 3.0～5.5 min, 40%A～95%A; 5.5～9.5 min, 95%A; 9.5～10.0 min, 95%A～10%A; 10.0～12.0 min, 10%A,流速:0.50 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣體積:10 μL;分析時間:12 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

非定向篩查質(zhì)譜條件 可加熱電噴霧離子(HESI)源,正負(fù)離子切換模式;檢測方式:全掃描數(shù)據(jù)依賴二級掃描(full MS-ddMS2);毛細(xì)管加熱溫度:320 ℃;鞘氣(N2)流速:40 L/min;輔助氣(N2)流速:10 L/min;吹掃氣(N2)流速:3 L/min;噴霧電壓:3 kV; Full MS掃描分辨率(R): 70 000;自動增益控制(AGC target): 3×106;最大駐留時間: 100 ms;掃描范圍:m/z100～1 500;閾值觸發(fā)值:1×105;頂點(diǎn)觸發(fā)時間: 2～8 s;動態(tài)排除時間:10 s; ddMS2掃描分辨率(R): 17 500;自動增益控制:1×105;最大駐留時間:50 ms; Top N: 5;分離窗口:m/z4.0;碰撞能量:40 eV;碰撞能量步進(jìn)值:50%。

定量分析質(zhì)譜條件 HESI源,正離子模式;檢測方式:目標(biāo)離子二級掃描(target-MS2);毛細(xì)管加熱溫度:320 ℃;鞘氣(N2)流速:40 L/min;輔助氣(N2)流速:10 L/min;吹掃氣(N2)流速:3 L/min;噴霧電壓:3 kV;分辨率(R): 17 500;自動增益控制:2×105;最大駐留時間:100 ms。

1.4.3篩查方法

通過full MS-ddMS2模式和Trace Finder軟件對從實(shí)際樣品中采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩查分析,檢索參數(shù)為:母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,峰閾值強(qiáng)度為1×104,信噪比(S/N)為5,子離子精確質(zhì)量偏差為1×10-5,匹配最少碎片個數(shù)為2,同位素豐度相似度為90%,同位素精確質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,在包含1 729種環(huán)境污染物的數(shù)據(jù)庫中檢索,篩查過程中全部符合以上設(shè)置條件的化合物為初篩通過。初篩通過的化合物采用Library Manager進(jìn)行二級譜圖庫對比,二級離子質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,保留時間限定為±0.5 min,相似度大于0.7視為確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩查方法的確立

為保證所建立的篩查方法在樣品通用前處理過程、整個質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集過程及篩查分析過程的精密度和準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)選取8種具有極性和保留時間差異的農(nóng)藥污染物(嗎菌靈、氯吡脲、高滅磷、二丙烯草胺、噻嗪酮、卡巴呋喃、綠麥隆、二苯胺)作為質(zhì)控化合物對整個篩查過程進(jìn)行監(jiān)測。選擇空白水產(chǎn)樣品添加0.05 μg/g水平的上述8種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為監(jiān)測樣品,采用篩查過程所用前處理方法,按實(shí)驗(yàn)中的色譜-質(zhì)譜條件選擇含有1 729種污染物的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配分析,對母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差、子離子精確質(zhì)量數(shù)偏差、同位素豐度等條件進(jìn)行優(yōu)化,為保證上述8種化合物均能通過數(shù)據(jù)庫匹配,優(yōu)化后設(shè)置的母離子及子離子精確質(zhì)量數(shù)偏差1×10-5,同位素豐度相似度90%。進(jìn)樣時將監(jiān)測樣品一同分析,保證篩查過程的有效性。8種農(nóng)藥污染物的提取離子流圖見圖1。

圖 1 8種農(nóng)藥污染物的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight pesticide pollutants

本實(shí)驗(yàn)通過對405個水產(chǎn)樣品應(yīng)用1 729種環(huán)境污染物的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行初步篩查,結(jié)果表明樣品中存在我國未要求限量的風(fēng)險化合物三環(huán)唑、乙氧基喹啉、咖啡因和速滅威。

2.2 定性分析

藥物非定向篩查基于高分辨數(shù)據(jù)庫,高分辨數(shù)據(jù)庫集儲存化合物多方位信息和化合物歸類一體化。實(shí)驗(yàn)將待篩查項(xiàng)目中涉及的所有化合物信息導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫,構(gòu)成一個專屬性強(qiáng)的項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫所包含的信息:化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、美國化學(xué)文摘登記號(Chemical Abstracts Service)、離子化方式、分類、保留時間及碎片離子精確質(zhì)量數(shù)信息等;此外,與高分辨數(shù)據(jù)庫結(jié)合進(jìn)行化合物信息確證的Library Manager軟件有二級碎片離子譜圖儲存功能,可儲存化合物在一定碰撞能下的二級質(zhì)譜圖,用于二級譜圖相似度檢索比對,為化合物定性確證提供更有利的匹配條件,減少假陽性。在篩查分析時根據(jù)需要進(jìn)行條件設(shè)置,可提高篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。但譜圖庫的數(shù)據(jù)量較大,過程建立復(fù)雜,需要的存儲空間較大。本實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行基于高分辨數(shù)據(jù)庫的二級碎片篩查分析,對于篩查過程中發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險化合物三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉和速滅威,將其與標(biāo)準(zhǔn)品的高分辨二級碎片譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行二級離子碎片相似度較,通過優(yōu)化精確質(zhì)量數(shù)偏差、對比與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的差值進(jìn)一步提高篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性,最終確定實(shí)際分析中二級離子質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,保留時間差限定為±0.5 min,相似度大于0.7。圖2為樣品中檢出化合物與標(biāo)準(zhǔn)品的二級譜圖碎片定性確認(rèn)對比圖,樣品中篩查出的三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉與實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品保留時間差小于0.5 min,并且譜圖相似度在0.75～0.95之間,定性通過,可進(jìn)一步進(jìn)行定量分析。由于速滅威標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際水產(chǎn)樣品中篩查出的化合物保留時間差為3 min,譜圖相似度在0.44～0.54之間,故定性失敗,因此,最終確定樣品中含有三環(huán)唑、咖啡因和乙氧基喹啉。

圖 2 陽性樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的二級碎片離子對比圖Fig. 2 Comparison of fragment ion mass spectra between positive samples and standards

2.3 定量分析條件的優(yōu)化和方法學(xué)驗(yàn)證

無凈化步驟的通用前處理過程可避免化合物的漏檢,但因存在基質(zhì)效應(yīng)干擾較大,檢測靈敏度低[16]。水產(chǎn)品中含有蛋白質(zhì)和脂肪,基質(zhì)成分較復(fù)雜[17],直接提取條件下8種作為質(zhì)控的農(nóng)藥回收率為40%～70%。需要優(yōu)化前處理過程對陽性樣品中篩出的化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

相比于甲醇和乙酸乙酯,乙腈沉淀蛋白質(zhì)的效果較好,對三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉這3種化合物的提取效率較高,因此前處理采用乙腈提取。比較了固相萃取柱和QuEChERS方法對前處理過程的凈化效果。結(jié)果表明,Envi-Carb串聯(lián)PSA柱的凈化效果一般且費(fèi)時,QuEChERS法處理快速且除脂效果較好。分別對除水劑和凈化劑的選擇進(jìn)行優(yōu)化,選取無水硫酸鎂作為除水劑時各化合物的回收率均較高,C18和PSA作為凈化劑可去除大部分脂質(zhì),石墨化炭黑加入后對部分含苯環(huán)化合物有一定的吸附作用,回收率偏低,其主要用于去除色素[18],而水產(chǎn)品中色素含量較少,因此選擇C18和PSA對樣品進(jìn)行凈化。

質(zhì)譜分析采用電噴霧正離子源,分別將質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的三環(huán)唑、乙氧基喹啉、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描,選擇各化合物的分子離子優(yōu)化碰撞能量并選擇干擾較少的子離子分別作為定性定量離子,見表1。配制質(zhì)量濃度范圍為5～1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各物質(zhì)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,3種化合物在5～1000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2均大于0.99。3種化合物的檢出限(LOD)均為1 μg/kg,定量限(LOQ)均為5 μg/kg。分別在魚肉、蝦肉樣品中進(jìn)行5、10、20 μg/kg 3個水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),3個添加水平下各化合物的平均回收率及精密度見表2。

表 1 3種化合物的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MS parameters of three compounds

*Quantitative ion.

表 2 3種環(huán)境污染物在魚、蝦樣品中的加標(biāo)回收率和 精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of the three environmental pollutants spiked in fish and shrimp samples (n=6)

2.4 定量分析與定性分析結(jié)果比較

將三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉3種化合物在陽性樣品中的定量分析結(jié)果與定性結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):通過篩查方法定性確認(rèn)的3種化合物在進(jìn)行陽性樣品定量時也均分別檢出三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉,且這3種化合物定量時采用的定性及定量離子均在篩查方法選用的子離子中,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的離子豐度比匹配度達(dá)80%以上。說明定性篩查方法準(zhǔn)確,對于篩查通過的化合物可進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析。

2.5 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果及分析

利用建立的初篩方法對405個水產(chǎn)樣品進(jìn)行高通量篩查定性分析,樣品包括鯽魚、鱖魚、黑魚、草魚、羅氏沼蝦、羅非魚、肉蟹、對蝦等品種,通過初步篩查確認(rèn)樣品中存在三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉3種污染物。采用優(yōu)化后的條件對陽性樣品進(jìn)行三環(huán)唑、咖啡因、乙氧基喹啉的定量分析,結(jié)果表明,樣品中三環(huán)唑的檢出率為1.2%,含量范圍在10.1～16.5 μg/kg;咖啡因檢出率為1.7%,含量范圍在5.2～5.8 μg/kg;乙氧基喹啉檢出率為1.2%,含量范圍在8.4～12.1 μg/kg。對結(jié)果進(jìn)行分析,其中三環(huán)唑?yàn)檗r(nóng)藥污染物,推測是由于不規(guī)范使用農(nóng)藥帶來的水源或農(nóng)作物污染,進(jìn)而富集到水產(chǎn)品中[19];咖啡因是一種優(yōu)勢污染物,在國內(nèi)湖泊及地表水中均有檢出,其常在咖啡、茶、巧克力及可樂型飲料中用作興奮劑、苦味劑和香料;此外咖啡因也是一種重要的解熱鎮(zhèn)痛藥,復(fù)方阿司匹林的主要成分之一,在當(dāng)今社會使用非常廣泛[20,21],因此水產(chǎn)品檢出咖啡因可能是由于水體污染造成的;乙氧基喹啉作為抗氧化劑常在飼料或漁用藥物中投入使用。目前GB 2763-2016中制定了三環(huán)唑在稻谷和蔬菜中的最大殘留限量為2 mg/kg,水果中乙氧基喹啉的最大殘留限量為3 mg/kg[20],水產(chǎn)品中均無相關(guān)要求。水產(chǎn)品中農(nóng)藥限量僅滴滴涕和六六六兩項(xiàng)[22],與發(fā)達(dá)國家相比處于被動和落后的局面,引起關(guān)注度較低,建議今后加強(qiáng)重視程度,繼續(xù)開展深入的風(fēng)險監(jiān)測工作。

3 結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法結(jié)合Trace Finder篩查軟件對水產(chǎn)品中未知環(huán)境污染物進(jìn)行高通量非定向篩查分析并確證,在此基礎(chǔ)上優(yōu)化前處理?xiàng)l件對篩查化合物準(zhǔn)確定量。篩查方法具有快速、高通量、高靈敏度特點(diǎn),定量準(zhǔn)確,可用于未知化學(xué)風(fēng)險的監(jiān)測分析,為有關(guān)風(fēng)險評估部門監(jiān)管污染物風(fēng)險來源提供方向。