黃 娟, 桂茜雯, 高 玲, 張曉燕, 沈偉健, 吳 斌, 丁 濤

(南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 江蘇 南京 210019)

雙甲脒(amitraz, AMZ)又稱N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺,是一種常見的有機(jī)氮?dú)⑾x劑和殺螨劑,已廣泛用于果樹、蔬菜、茶葉、棉花等作物的害蟲防治[1]。單甲脒(semiamitraz, DMPF)是雙甲脒代謝的中間產(chǎn)物之一,也是良好的殺螨殺蟲劑,對(duì)螨的各個(gè)蟲期(卵、若蟲、成蟲)和抗性螨均有很好的防治效果,曾因其不穩(wěn)定而無法商品化。但1987年科技工作者解決了關(guān)鍵技術(shù),開始將單甲脒水劑工業(yè)化生產(chǎn),并大面積推廣應(yīng)用[2]。雙甲脒及其代謝產(chǎn)物均具有致癌性和可傳遞性,吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收均會(huì)引起中毒,對(duì)肝臟損傷較大,會(huì)對(duì)人體及動(dòng)物造成危害[3],其中單甲脒原藥的毒性大于雙甲脒[4]。

由于雙甲脒及其代謝產(chǎn)物的危害嚴(yán)重,各國紛紛制訂雙甲脒在食用農(nóng)產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn),以保證質(zhì)量安全。其中,在GB 2763-2016標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定雙甲脒及其代謝產(chǎn)物在除棉籽油外的其他基質(zhì)中最大殘留限量為0.5 mg/kg,在棉籽油中為0.05 mg/kg[5]。美國規(guī)定根據(jù)基質(zhì)的不同雙甲脒的限量值在0.02～9 mg/kg之間[6]。日本規(guī)定在蔬菜水果中雙甲脒及其代謝產(chǎn)物的限量值在0.2～0.5 mg/kg之間[7]。

目前關(guān)于AMZ及其最終代謝產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺(2,4-dimethylaniline, DMA)的研究報(bào)道較多,研究基質(zhì)主要為動(dòng)物源性食品,如蜂蜜、牛奶、水產(chǎn)品等,方法主要采用氣相色譜法[8]和氣相色譜-質(zhì)譜法[9-11],高效液相色譜法[12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13]也偶有報(bào)道。

但實(shí)際上,在自然界中AMZ易首先代謝產(chǎn)生DMPF和2,4-二甲基苯基甲酰胺(2,4-dimethylformamidine, DMF)兩種中間產(chǎn)物,在沒有高溫、高濕或酸、堿的環(huán)境中,各種代謝產(chǎn)物都可以穩(wěn)定、獨(dú)立存在,因此對(duì)每種化合物的殘留檢測(cè)都很重要。目前國內(nèi)外基本集中研究AMZ和DMA[9,11,12],而對(duì)DMPF和DMF的研究較少。郭浩等[14]和侯建波等[15]分別針對(duì)水和蜂王漿的基質(zhì)研究了同時(shí)檢測(cè)AMZ及其代謝產(chǎn)物等4種化合物的方法,但對(duì)于蔬菜水果這類種類較多且含水含色素較多的復(fù)雜基質(zhì)尚無報(bào)道。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)在抗基質(zhì)干擾能力、準(zhǔn)確性和靈敏度方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì),本文利用該技術(shù)建立了檢測(cè)蔬菜水果基質(zhì)中AMZ、DMPF、DMF和DMA 4種化合物殘留量的方法。該法靈敏度高,定量限(LOQ)低于各國殘留限量要求,且穩(wěn)定性和專屬性強(qiáng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀(配備ESI源,美國Thermo公司); Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司); Buchi R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司); WH-861渦旋混勻器(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); SLGMA2-16K高速離心機(jī)(德國Sartorius公司); Z216MK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Hermle Labortechnic公司); SMART-N15VF超純水系統(tǒng)(上海力康超純水有限公司)。

AMZ、DMPF、DMF和DMA(純度≥98.5%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;正己烷、異丙醇、氫氧化鈉(分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司);甲醇和乙腈(色譜純,德國Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水系統(tǒng)制備的二級(jí)水和三級(jí)水。

實(shí)驗(yàn)用樣品均為送至本實(shí)驗(yàn)室的待檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于0～4 ℃冷藏儲(chǔ)存,備用。

取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈-水(50∶50, v/v)逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,于0～4 ℃冷藏儲(chǔ)存,備用。

準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液,用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取混合均勻的樣品5.0 g(精確至0.01 g),置于50 mL塑料離心管中,加入5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,渦旋混勻1 min,再加入15 mL正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)提取液,渦旋混合1 min,以8 000 r/min離心5 min,吸取上層液轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃離心管中,于35～40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,用0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?轉(zhuǎn)移至1 mL離心管中;再用0.5 mL水溶解殘?jiān)?轉(zhuǎn)移至同一離心管中,渦旋混勻，然后以12 000 r/min離心3 min,溶液過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,供儀器分析。

1.4 分析條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～3.0 min, 10%B～90%B; 3.0～8.0 min, 90%B; 8.0～9.5 min, 90%B～10%B, 9.5～10.5 min, 10%B。進(jìn)樣量:25 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源;掃描方式為正離子掃描;離子源溫度為350 ℃;離子傳輸管溫度為300 ℃;毛細(xì)管電壓為3 200 V;氣簾氣為氮?dú)?壓力為0.060 MPa;輔助氣為氮?dú)?流量為5.0 L/h;碰撞氣為氬氣,壓力為0.2 Pa(1.5 mTor);檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。雙甲脒及其代謝產(chǎn)物的母離子、子離子和碰撞能量見表1。

圖 1 雙甲脒的代謝路徑Fig. 1 Metabolism routes of AMZ

CompoundParent ion (m/z)Daughter ion (m/z)Collision energy/eVAMZ294.26163.11*15122.2529DMPF163.08122.18*17107.1825DMF150.18107.00*21132.0413DMA122.09107.16*18105.1618

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

AMZ在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定,環(huán)境pH值小于2時(shí)迅速降解成DMA,在pH值為3～6時(shí),AMZ先水解成DMPF和DMF兩種中間體,然后再進(jìn)一步降解成穩(wěn)定的DMA(見圖1)。隨著pH值的提高,AMZ的水解速率明顯下降,穩(wěn)定性增高,因此在提取溶劑中加入堿性溶液,可以防止AMZ在提取過程中的降解。

AMZ為胺類化合物,屬于兩性化合物,加酸形成鹽,加堿形成游離分子,結(jié)合酸性易降解的特性和相似相容原理,在堿性條件下分子形態(tài)的AMZ更易被有機(jī)試劑溶解提取。本文考察了對(duì)AMZ及其代謝產(chǎn)物溶解度較大的丙酮、甲醇、正己烷和正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)4種有機(jī)試劑的提取效率(見圖2)。結(jié)果表明,丙酮和甲醇的提取效率較高,正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)和正己烷的提取效率較低,但對(duì)于本文研究的蔬菜水果基質(zhì)來說,丙酮由于吸附了較多的色素,使后期儀器分析中基質(zhì)干擾變大;甲醇除了吸附色素外,還因其具有親水性,會(huì)導(dǎo)致提取液中含有部分水分,從而使雙甲脒發(fā)生水解。正己烷作為非極性物質(zhì),可以在提取過程中將水分和易溶于水的色素剔除,從而達(dá)到提取和凈化的目的。在提取液中加入少量異丙醇,可以讓AMZ及其代謝產(chǎn)物在提取溶劑中更加穩(wěn)定,同時(shí)防止在后期的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中暴沸。因此本文選擇正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)作為提取溶劑。

圖 2 不同提取溶劑對(duì)4種目標(biāo)化合物提取效率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the extraction efficiencies of the four target compounds

2.2 定容溶劑的選擇

在儀器分析中,定容溶劑直接影響了分析物的峰形、分離度和靈敏度。色譜分析中,一般采用流動(dòng)相定容,本文比較了0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液和乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作為定容溶劑時(shí)的色譜分離效果。同時(shí)添加1 mL 1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至定容溶劑中,常溫放置一段時(shí)間,觀察放置時(shí)間對(duì)AMZ穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液定容后,AMZ在7 h時(shí)幾乎完全分解,而采用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液定容后,AMZ可以保持24 h內(nèi)穩(wěn)定存在(見圖3)。因此選擇乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作為定容溶劑。

圖 3 AMZ在不同定容溶劑中的降解圖Fig. 3 Degradation of the AMZ dissolved in the different solvents

圖 4 AMZ及其代謝產(chǎn)物(100 μg/L)的選擇離子 色譜圖和二級(jí)離子質(zhì)譜圖Fig. 4 SIM chromatograms and MS2 spectra of AMZ and its metabolites (100 μg/L)

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1質(zhì)譜參數(shù)

在正離子模式下對(duì)1.0 mg/L AMZ及其代謝產(chǎn)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,得到[M+H]-準(zhǔn)分子離子峰,分別選擇該分子離子峰進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜掃描。在MRM、正離子模式下,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),分別選擇信噪比高、峰形好、干擾小的子離子作為定量離子,選擇特異性強(qiáng)的子離子作為定性離子。圖4為AMZ及其代謝產(chǎn)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的選擇離子色譜圖和二級(jí)離子質(zhì)譜圖。

2.3.2基質(zhì)效應(yīng)

雙甲脒及其代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜上的離子抑制較強(qiáng),因此,本文測(cè)定了目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的峰面積,通過兩者峰面積差值的絕對(duì)值與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值,計(jì)算離子抑制率,來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,AMZ、DMPF、DMF和DMA的離子抑制率分別為23.9%、35.9%、7.9%和19.6%,說明基質(zhì)對(duì)AMZ、DMPF和DMA的離子抑制相對(duì)較強(qiáng)。因此本文采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液來減弱基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性范圍與定量限

取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液分別配制成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,按本方法確定的條件分別進(jìn)樣分析,以目標(biāo)化合物的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,4種目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99(見表2)。以信噪比(S/N)>10確定4種目標(biāo)化合物的定量限,結(jié)果為0.01～0.4 μg/kg。

表 2 4種目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r) and limits of quantification (LOQs) of the four target compounds

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2回收率和精密度

對(duì)青菜和柑橘兩種代表性基質(zhì)進(jìn)行0.5、5.0、20.0 μg/kg 3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)6次,測(cè)定兩種基質(zhì)中AMZ及其代謝產(chǎn)物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表3)。結(jié)果表明,方法的平均回收率為62.5%～105.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%～17.6%。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)近期送至本實(shí)驗(yàn)室的32批蔬菜包括黃瓜、青(紅)椒、茄子、玉米粒、針菇和番茄等各種基質(zhì)的樣品進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)共檢出4批陽性樣品,番茄樣品檢出AMZ,含量為1.5 μg/kg;黃瓜和白金針菇檢出DMA,含量分別為2.1 μg/kg和3.5 μg/kg;紅椒檢出DMPF,含量為0.2 μg/kg。

表 3 青菜和柑橘中AMZ及其代謝產(chǎn)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the AMZ and its metabolites at three spiked levels in green vegetable and orange samples (n=6)

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蔬菜水果中雙甲脒及其代謝產(chǎn)物的方法。該法采用串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方式，能有效排除復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾,并滿足對(duì)目標(biāo)化合物的定性定量檢測(cè)要求。