陳 磊, 劉 蕓, 陳 雷, 張曉燕, 馮 峰, 張 峰

(1. 南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019;2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176)

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹干處采集的樹脂混入蜜蜂上顎腺和蜂蠟等物質(zhì)形成的一種具有芳香氣味的黏性膠狀固形物[1],其作為蜜蜂生存環(huán)境的天然屏障,可以有效維持整個(gè)蜂群的健康。一個(gè)5～6萬只的蜂群一年只能生產(chǎn)蜂膠70～110 g,蜂膠被譽(yù)為“紫色黃金”。由此可見,蜂膠的實(shí)際產(chǎn)量并不大,但目前我國市場上的蜂膠類產(chǎn)品卻種類繁多,其中不乏楊樹膠制成的偽品。因此,對(duì)蜂膠進(jìn)行可靠的質(zhì)量控制非常重要。我國目前實(shí)施的蜂膠國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 24283-2009)中規(guī)定的感官指標(biāo)包括結(jié)構(gòu)、色澤、狀態(tài)、氣味和滋味,理化指標(biāo)包括乙醇提取物含量、總黃酮和氧化時(shí)間。在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn),這些指標(biāo)均不能有效區(qū)分蜂膠與楊樹膠,因?yàn)闂顦淠z也可以達(dá)到檢測要求。目前用于產(chǎn)地為中國的蜂膠摻假鑒別的國標(biāo)方法為GB/T 34782-2017。該方法利用高效液相色譜法檢測水楊苷和鄰苯二酚,對(duì)蜂膠和楊樹膠進(jìn)行鑒別。此外,還有基于高效液相色譜指紋圖譜法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GH/T 1087-2013)也能用于蜂膠摻假鑒別。但總的來說,蜂膠摻假的鑒別方法仍然偏少,不足以遏制目前的蜂膠摻假現(xiàn)象。

蜂膠的質(zhì)量取決于其中所含有效活性物質(zhì)的量。蜂膠中含有許多黃酮類、酚酸及其酯類、萜類和有機(jī)酸類物質(zhì)[2-4]。其中,黃酮類與酚酸及其酯類同屬酚類化合物,是蜂膠療效的最主要來源[5]。已有大量文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道,蜂膠中的這些生物活性物質(zhì)顯示出廣譜抗菌、抗腫瘤、殺菌,局部麻醉、抗炎、降低血壓、受激免疫及抑制細(xì)胞、穩(wěn)定細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞組織再生的生理活性。由于蜂膠含有的化學(xué)成分受植物來源影響比較大,所以在世界范圍內(nèi),不同地區(qū)蜂膠的化學(xué)成分也存在較大差異[10]。周夢瑤等[11]根據(jù)地域?qū)κ澜缰饕淠z的植物來源及其化合物組成進(jìn)行了綜述。張翠平等[12]根據(jù)植物來源將世界范圍內(nèi)的蜂膠分為楊樹屬型、酒神菊屬型、克魯西屬型、血桐屬型和地中海東部地區(qū)型5大類。其中,楊樹屬型蜂膠(例如中國蜂膠)和酒神菊屬型蜂膠(俗稱巴西綠蜂膠)被研究和報(bào)道的比較廣泛和深入。

本文選取酚類化合物為研究對(duì)象,以高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜為研究手段,通過測定中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠、楊樹膠中的主要酚類化合物,進(jìn)行定量檢測和差異性分析,篩選能用于辨別中國楊樹型蜂膠真?zhèn)?、區(qū)別中國楊樹型蜂膠和巴西綠蜂膠的特征標(biāo)志物,以改善現(xiàn)有的蜂膠質(zhì)控方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260液相色譜儀串聯(lián)6530飛行時(shí)間質(zhì)譜,配有自動(dòng)脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件(美國Agilent公司); PURELAB Option Q5超純水制備儀(英國ELGA公司); KH-500B型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

中國楊樹型蜂膠、楊樹膠樣品采集自山東、湖北、河南、江蘇等地,巴西綠蜂膠為進(jìn)出口企業(yè)送檢樣品。為保證樣品的含膠量一致,所選蜂膠及樹膠樣品均為乙醇提取物。

咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜化學(xué)試劑有限公司,純度均不小于99.5%;乙腈和甲醇(均為色譜純,德國Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇定容至10 mL,得到1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。臨用前用甲醇逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度。

圖 1 23種酚類化合物(200 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 23 phenolic compounds (200 μg/L)

1.3 樣品前處理

稱取約0.2 g樣品,加入適量甲醇,超聲約15 min至完全溶解后,用甲醇定容至50 mL。取500 μL上述甲醇溶液至1.5 mL塑料離心管中,加超純水500 μL,渦旋混勻后以12 000 r/min的速度離心3 min,上清液過0.45 μm有機(jī)相濾膜后進(jìn)樣。由于樣品中有些化合物含量非常高,用甲醇-水(1∶1, v/v)分別稀釋10、100和1 000倍后再次進(jìn)樣。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:200 μL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:A相為乙腈,B相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 30%A; 1.0～5.5 min, 30%A～55%A; 5.5～15.0 min, 55%A～70%A; 15.0～16.0 min, 70%A～30%A; 16.0～20.0 min, 30%A。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;檢測模式:正離子;干燥氣流速:5 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;霧化氣壓力:310 kPa;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:12.0 L/min,離子掃描范圍:m/z100～1 000。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件(美國SPSS公司)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(95%置信區(qū)間),分別比較中國楊樹型蜂膠與巴西綠蜂膠,中國楊樹型蜂膠與楊樹膠之間23種酚類化合物的含量差異,篩選特征化合物。

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍、檢出限與定量限

分別取適量23種化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇-水(1∶1, v/v)逐級(jí)稀釋至200、100、50、20、10 μg/L。按照上述儀器條件檢測后,以化合物的峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X(μg/L)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算得到23種化合物的校正曲線方程。23種酚類化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。桔皮素和刺芒柄花素的檢出限和定量限分別為0.2和1 μg/L,其他化合物的檢出限和定量限分別為2和10 μg/L。23種酚類化合物的提取離子色譜圖見圖1。

2.2 精密度和回收率

在10、25和50 mg/kg 3個(gè)添加水平下,分別考察23種酚類化合物在中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中的提取回收率。每個(gè)添加水平分別重復(fù)3次試驗(yàn),結(jié)果如表1所示,23種酚類化合物在3種

樣品基質(zhì)中的提取回收率為70.2%～122.6%, RSD值均小于10%,滿足定量分析方法的要求。

2.3 實(shí)際樣品檢測

采用本文建立的檢測方法對(duì)10個(gè)中國楊樹型蜂膠、8個(gè)巴西蜂膠和10個(gè)楊樹膠中23種酚類化合物的含量進(jìn)行測定,結(jié)果見表2。楊樹膠中阿魏酸、肉桂酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量比較高。中國楊樹型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素含量比較高。巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素、阿替匹林C含量比較高。3種樣品中均沒有檢測到蘆丁、楊梅酮、刺芒柄花素和桔皮素。

表 1 23種酚類化合物在中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中的回收率和精密度(n=3)Table 1 Recoveries and precisions of the 23 phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum (n=3)

表 2 楊樹膠(n=10)、中國楊樹型蜂膠(n=10)和巴西綠蜂膠(n=8)中23種酚類化合物的含量Table 2 Contents of the 23 phenolic compounds in poplar gum (n=10), Chinese poplar propolis (n=10), and Brazil green propolis (n=8)

-: not detected.

中國楊樹型蜂膠和楊樹膠的主要植物來源都是楊樹,檢測結(jié)果顯示這兩組樣品中白楊素、松屬素、高良姜素含量都非常高,與文獻(xiàn)結(jié)論一致[10-12]。另外,這兩組樣品中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯的含量也都很高。已有較多文獻(xiàn)[13-17]報(bào)道中國楊樹型蜂膠中這兩種化合物的含量較高。但是由于楊樹膠的相關(guān)研究較少,這兩種化合物在楊樹膠中的含量情況目前還存在疑問。如曹煒等[18]報(bào)道,楊樹芽提取物中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯都有檢出,而Zhang等[19]報(bào)道楊樹膠中未檢出阿魏酸。

正是由于楊樹膠和中國楊樹型蜂膠的化合物組成存在諸多的相似性,所以楊樹膠經(jīng)常用于中國楊樹型蜂膠的摻假。根據(jù)本文的檢測結(jié)果,兩者也有許多化合物的含量存在明顯的差異,可以用于中國楊樹型蜂膠摻假鑒別。例如水楊苷和肉桂酸,在楊樹膠中的含量遠(yuǎn)高于中國楊樹型蜂膠(P<0.05),可以作為楊樹膠的特征化合物;反之,咖啡酸和香豆酸在中國楊樹型蜂膠中的含量遠(yuǎn)高于楊樹膠(P<0.05),可以作為中國楊樹型蜂膠的特征化合物。在進(jìn)行中國楊樹型蜂膠的摻假鑒別時(shí),綜合考察楊樹膠和中國楊樹型蜂膠兩方面的特征化合物所得出的判定結(jié)論將會(huì)更加準(zhǔn)確。其中,水楊苷、咖啡酸、香豆酸用于中國楊樹型蜂膠的摻假鑒別已有文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道,肉桂酸在中國楊樹型蜂膠和楊樹膠中的含量差異尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

巴西蜂膠的主要植物來源為酒神菊樹,其化合物組成與中國楊樹型蜂膠存在較大的差異。檢測結(jié)果顯示,中國楊樹型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量遠(yuǎn)高于巴西蜂膠(P<0.05),可以作為中國楊樹型蜂膠的特征化 合物。而巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C的含量遠(yuǎn)高于中國楊樹型蜂膠(P<0.05),可以作為巴西蜂膠的特征化合物。其中,阿替匹林C作為巴西綠蜂膠的特有化合物已經(jīng)有較多文獻(xiàn)[21,22]報(bào)道,而香豆酸、異鼠李素和山柰素在巴西綠蜂膠中的含量情況文獻(xiàn)報(bào)道較少[23]。

對(duì)于蜂膠中是否存在蘆丁,一直存在較大爭議。在早期的文獻(xiàn)和蜂膠標(biāo)準(zhǔn)[24-26]中,認(rèn)為蜂膠中存在一定含量的蘆丁。但是近來有越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道[18,19,27]蜂膠中并沒有檢測到蘆丁。因?yàn)槊鄯湓诓杉淠z時(shí),唾液中含有的β-糖苷酶能水解連接在苷元上的糖配基[28]。因此,蜂膠中不含有蘆丁應(yīng)該是比較可靠的結(jié)論。

3 結(jié)論

本文建立了一種同時(shí)檢測中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中23種酚類化合物的高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜方法,該方法簡單、準(zhǔn)確、可靠。此外,通過檢測實(shí)際樣品中23種酚類化合物的含量并進(jìn)行差異性分析,提出水楊苷、肉桂酸、咖啡酸和香豆酸可以作為中國楊樹型蜂膠摻假鑒別的特征化合物,而咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素、香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C可以作為辨別中國楊樹型蜂膠和巴西蜂膠的特征化合物。