文/王玉堂

在治療動(dòng)物的細(xì)菌性、病毒性等疾病過(guò)程中，因長(zhǎng)期和大量使用抗生素，使得某些病原體對(duì)藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性（抗藥性），而導(dǎo)致無(wú)法有效治療或控制疾病。研發(fā)新型抗生素的周期長(zhǎng)（一般30年為一周期）、難度大、費(fèi)用高，另一方面因水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度遠(yuǎn)超過(guò)抗生素的研發(fā)速度，現(xiàn)有的抗生素開(kāi)發(fā)策略多局限于既有的抗生素類(lèi)別，難以有實(shí)質(zhì)性的突破，一種新的抗生素出現(xiàn)不久就會(huì)有病菌產(chǎn)生耐藥性?？垢腥拘蝿?shì)的嚴(yán)峻性迫切需要尋找出與現(xiàn)有的抗生素機(jī)理完全不同的新型抗菌物質(zhì)。而抗菌肽作為一種新型高效的抗菌藥物，由于其分子量小、水溶性好、抗菌譜廣、作用機(jī)制特別、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為新型抗生素開(kāi)發(fā)的良好選擇。

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，尤其是抗菌肽對(duì)耐藥致病菌有良好的殺滅或抑制作用為治療相關(guān)疾病提供了一個(gè)新的途徑?？咕氖蔷珳?zhǔn)的氨基酸片段，是廣泛存在于細(xì)菌、植物、軟體動(dòng)物、兩棲類(lèi)動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類(lèi)小分子多肽，由20個(gè)～60個(gè)氨基酸殘基組成；由兩個(gè)氨基酸以肽鍵組成的肽稱(chēng)為“二肽”，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱(chēng)為“多肽”，因氨基酸組分和順序各不相同而組成不同的肽。通常10肽以下者較具醫(yī)藥及商業(yè)價(jià)值。抗菌肽具有活性強(qiáng)、功能廣泛、廣譜殺菌作用，在應(yīng)用研究中有重要價(jià)值，這一新領(lǐng)域已引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注?？咕暮铣傻乃俣确浅？?，與以恒定速度合成的肽鍵相比，抗菌肽的生產(chǎn)比IgM快100多倍，因此稱(chēng)抗菌肽是機(jī)體理想的第一道防線(xiàn)，目前已有多個(gè)魚(yú)類(lèi)抗菌肽基因不僅被分離出來(lái)，還在活體內(nèi)對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)。

一、抗菌肽的來(lái)源、結(jié)構(gòu)與分類(lèi)

抗菌肽最開(kāi)始被定義為昆蟲(chóng)體內(nèi)神經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。早在1972年，Boman等研究北美天蠶免疫投機(jī)時(shí)，發(fā)現(xiàn)惜古比天蠶（Hyalophoracecropia）在受外界條件刺激后，其免疫血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了一種具有抑菌作用的多肽物質(zhì)，該物質(zhì)隨后被命名為天蠶素（Cecropin）。此后，人們相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類(lèi)、昆蟲(chóng)、高等植物、哺乳動(dòng)物及至人體中分離到多種具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，至今已分離到2000多種。1986年，Lazarovici等從石紋豹鰨（Pardachirus marmoratus）的皮膚中分離到一種名為豹鰨毒素（Pardaxin）的抗菌肽，這是首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的魚(yú)類(lèi)抗菌肽，迄今為止已克隆和鑒定了150多種魚(yú)類(lèi)抗菌肽。魚(yú)類(lèi)抗菌肽與其它物種的抗菌肽相比殺菌作用更強(qiáng)，但同源性較低，種間差異大。

抗菌肽屬于小分子多肽，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。研究發(fā)現(xiàn)，不同抗菌肽在肽鏈長(zhǎng)度、序列組成以及生化結(jié)構(gòu)上都有顯著差異，但通常具備兩個(gè)共同特點(diǎn)：一是抗菌肽屬于陽(yáng)離子多肽；二是抗菌肽具有兩親性結(jié)構(gòu)（親水性和親油性），疏水性氨基酸殘基包括丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，親水性氨基酸至少含有2個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基、精氨酸或賴(lài)氨酸，因?yàn)榫彼岷唾?lài)氨酸的存在通常帶有2個(gè)～7個(gè)凈正電荷，表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽(yáng)離子特征。翻譯后的修飾如二硫鍵的形成、C端酰胺化、N端形成焦谷氨酸以及較少的糖基化，有助于某些抗菌肽維持穩(wěn)定性和活性。此外，單個(gè)抗菌肽的多個(gè)亞型是由N-末端的改變而生成。一旦前肽產(chǎn)生，便可通過(guò)蛋白水解過(guò)程加工釋放具有生物活性的多肽，這種蛋白水解過(guò)程取決于分泌抗菌肽的組織或細(xì)胞類(lèi)型。由于抗菌肽屬于具有兩親性的陽(yáng)離子多肽，因此，它們的疏水性、正電荷網(wǎng)絡(luò)、柔性構(gòu)象以及二級(jí)結(jié)構(gòu)都相互影響著它們的生物功能。

按照來(lái)源，抗菌肽可分為動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌來(lái)源的抗菌肽。按照其功能可分為抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲(chóng)和抗腫瘤抗菌肽。按照其結(jié)構(gòu)可分為線(xiàn)性α-螺旋肽（此類(lèi)抗菌肽由于富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，作用于細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)，可與細(xì)胞膜相互折疊，形成一個(gè)可以穿透細(xì)胞膜的疏水結(jié)構(gòu)，如天蠶素、蛙皮素等）、含有兩個(gè)或兩個(gè)以上以二硫鍵且具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽（如Hepcidin、Leap2、β-defensin等）、呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌短肽（如Cyclopsychotride）、散亂結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展肽（該類(lèi)抗菌肽目前較為罕見(jiàn)，以Bacterianecin抗菌肽為代表）、由其它已知功能的多肽衍生的具有抗菌活性的肽類(lèi)物質(zhì)五大類(lèi)。目前報(bào)道的魚(yú)類(lèi)抗菌肽在氨基酸序列上無(wú)較大的同源性，但是，其具有相似的結(jié)構(gòu)和共同的特征，如下載電荷、兩親性和疏水性等。

二、魚(yú)類(lèi)抗菌肽的生化特點(diǎn)和組成

魚(yú)類(lèi)抗菌肽是一類(lèi)小分子蛋白質(zhì)，其組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，分子量大小和氨基酸組成各不相同，但它們根據(jù)一定特點(diǎn)所組成，如含有較多的半胱氨酸，形成較保守的α-螺旋結(jié)構(gòu)；含有較多的陽(yáng)離子氨基酸如精氨酸或賴(lài)氨酸等而使分子帶正電荷。根據(jù)其生化和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將它們分成若干類(lèi)型：

第一類(lèi)：富含某種氨基酸的線(xiàn)性抗菌肽。此種類(lèi)型的抗菌肽因富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用時(shí)可以折疊成有利于穿膜的疏水或雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，能選擇地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些部分，如帶陽(yáng)離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。這類(lèi)分子還包括來(lái)源于虹鱒血清的salmocidin；八目鰻小腸的HFIAPs（hag fi sh intestinal antimicrobial peptides）；分離自泥鰍的misgurin；來(lái)源于雜交斑紋鱸皮膚、鰓和血液肥大細(xì)胞的piscidins以及分離自美洲擬鰈和豹鰨體有粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中Brocal I，F(xiàn)alco A等人從刺泥鰈的皮膚粘液中分離出一種25氨基酸的線(xiàn)性抗菌肽pleurocidin（Ple），具有與其它許多抗菌肽類(lèi)似的兩親性、α-螺旋結(jié)構(gòu)的鱸魚(yú)的皮膚和鰓可表達(dá)分泌的moronecidin抗菌肽。鱸魚(yú)moronecidin前體有79個(gè)氨基酸殘基，由信號(hào)肽、成熟肽和C片段3部分組成，氨基酸殘基數(shù)分別為22、22和35。經(jīng)圓二色譜分析其結(jié)構(gòu)呈α-螺旋。

第二類(lèi)：含多個(gè)半胱氨酸分子內(nèi)形成環(huán)狀的抗菌肽類(lèi)，這類(lèi)抗菌肽由于含多個(gè)半胱氨酸而形成多個(gè)二硫鍵，從而使其二級(jí)結(jié)構(gòu)呈β折疊。這類(lèi)分子包括來(lái)源于羅非魚(yú)的hepcidin和從克海七鰓鰻的皮膚上分離到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP（lamprey corticostatin-related peptidi）等，其中hepcidin基因大概含有20個(gè)～25個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部有8個(gè)高度保守的半胱氨酸，形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，它有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中有1個(gè)長(zhǎng)為273bp的ORF順序，編碼1個(gè)含有90多個(gè)氨基酸殘基的前多肽原；前多肽原包含3個(gè)區(qū)域，信號(hào)肽、成熟肽和由40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前hepcidin原。羅非魚(yú)hepcidin原類(lèi)型目前報(bào)道的有3種，分別命名為T(mén)H1-5、TH2-2和TH2-3，前體肽分別有88、86和91個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量分別為9.5、9.4和9.8ku；三信號(hào)肽裂解位點(diǎn)分別位于第24～25、第22～23和第24～25密碼子上，在共同的保守區(qū)域，都含有8個(gè)半胱氨酸。羅非魚(yú)中的TH2-3和日本鰈魚(yú)的JF2相似，TH2-2和日本的JF1相似，TH1-5和鯛的hepcidin類(lèi)似；通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)模型表明，在半胱氨基酸部位都形成二硫鍵。從斑馬魚(yú)分離到的β-defensins有3種，分別命名為zfDB1、zfDB2和zfDB3。與哺乳動(dòng)物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6個(gè)半胱氨酸，形成3個(gè)二硫鍵，并形成的模式一致，即第1～5、第2～4和第3～6個(gè)半胱氨酸。結(jié)構(gòu)都呈β折疊，但zfDB1的N端有1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。

第三類(lèi)：組蛋白樣抗菌肽（histone-like proteins，HLPs）。這類(lèi)肽在水生動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)于魚(yú)類(lèi)中，蝦類(lèi)、貝類(lèi)中尚未見(jiàn)報(bào)道。如從鯰、斑紋鱸魚(yú)、銀大馬哈和鮭等的皮膚粘液、鰓、血液和肝臟中分離的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和質(zhì)譜分析表明，它們與組蛋白H2A、H2B和H1非常相似。從大西洋鮭皮膚粘液中分離的SAMP H1（samonantimicrobial peptide H1）含有30個(gè)氨基酸殘基，中間富含Pro，N端乙?；?，但對(duì)其抗菌活性沒(méi)有影響；理論上的相對(duì)分子量為2836u。經(jīng)圓二色譜分析，其活性形式比非活性形式分子結(jié)構(gòu)上顯得緊湊和更具剛性。從鮒魚(yú)紅細(xì)胞上分離得到的一種特異蛋白H1與SAMP H1的氨基酸順序有78%的同源性，有3個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，是鮒魚(yú)紅細(xì)胞上一種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。從鯰魚(yú)受傷皮膚粘液分離得到的parasin I是由H2A組蛋白經(jīng)酶cathepsin D在其N(xiāo)端Ser19-Arg20位置裂解作用后產(chǎn)生的一種抗菌肽。parasin I含有19個(gè)氨基酸殘基，具有廣譜抗菌活性。Jorge等從彩虹鮭魚(yú)皮膚分泌物中分離提取了1種新的抗菌肽Oncorhyncin Ⅱ，指出這種抗菌肽的前17氨基酸殘基與來(lái)自彩虹鮭魚(yú)組蛋白H1的前138～154個(gè)殘基相同，并測(cè)得其分子量為719513Da。從而指出這個(gè)Oncorhyncin Ⅱ抗菌肽是組蛋白H1的C末端69殘基的片段。從鱈體表粘液中分離得到的幾種抗菌肽活性因子，通過(guò)弱陽(yáng)離子的交換色譜法和反相色譜層析技術(shù)，分離出來(lái)3種小肽，通過(guò)N端和C端氨基酸順序分析和質(zhì)譜分析，它們分別為核糖肽類(lèi)L40（6397Da）、L36A（12340Da）、L35（14215Da）。

第四類(lèi)：經(jīng)酰胺化、糖基化修飾的抗菌肽。這類(lèi)肽由核糖體合成后，在高爾基體濃縮、加工時(shí)，在相關(guān)酶的作用下脫掉C端1個(gè)或多個(gè)氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合而成有活性的成熟肽。這類(lèi)肽在蝦類(lèi)和一些海水魚(yú)類(lèi)中比常見(jiàn)。如從健康的南美白對(duì)蝦血細(xì)胞和血漿中分離出了幾種抗菌活性因子，通過(guò)酶剪切、Edman降解、質(zhì)譜儀分析等方法以及從血細(xì)胞的cDNA庫(kù)中進(jìn)行cDNA克隆，測(cè)定序列，發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦抗菌肽penaeidins具有其中一種肽的N端因形成焦谷氨酸而封閉；C端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它們的N一端富含脯氨酸。而C一端含有6個(gè)半胱氨酸組成的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，使它們的結(jié)構(gòu)有別于其它類(lèi)群的抗菌肽。還有從鯉體表粘液中分離出的27KD疏水蛋白和從丁鯛和鰻鱺皮膚粘液中分離出的分子量分別為65KD、49KD和45KD3種抗菌肽也是經(jīng)糖基化修飾的多肽。Jorge等從彩虹鮭魚(yú)的皮膚中分離出的一種新的具有抗菌功能的核糖肽類(lèi)，測(cè)得其分子量大小為667616Da，并指出這種肽與40S的核糖體蛋白S30非常相似。Jorge等還從彩虹鮭魚(yú)的血細(xì)胞中分離出的具有抗菌特性的活性片段，研究得出這種活性片段對(duì)熱敏感，且能被蛋白酶所消化，從而推斷這一活性片段為一種類(lèi)似蛋白質(zhì)的具有抗菌活性的天然成分。

三、魚(yú)類(lèi)抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)和功能

隨著研究的深入，一些抗菌肽基因被陸續(xù)克隆。2006年，劉碧蓮等根據(jù)GenBank中收錄的魚(yú)類(lèi)抗菌肽hepcidin的DNA序列設(shè)計(jì)特定的引物，用RT-PCR法從鱖魚(yú)肝臟中克隆到hepcidin的cDNA，并構(gòu)建Pmd18-Thepcidin載體進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果表明，該cDNA長(zhǎng)為381bp，其中第20～277位核基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼86個(gè)氨基酸，形成由信號(hào)肽（24個(gè)殘基）、前肽（42個(gè)殘基）和成熟肽（20個(gè)殘基）3部分序列組成的前體肽，與已報(bào)道的其它鱸形目魚(yú)類(lèi)hepcidin相比，核苷酸序列的同源性為72.2%～92.0%，所推導(dǎo)的成熟肽與包括人類(lèi)在內(nèi)的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50%～86.4%。Park等經(jīng)質(zhì)譜和化學(xué)分析方法研究證實(shí)，8個(gè)保守的cys殘基形成4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵可使β-折疊結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由Campagna S，Saint N等人2007年從條紋鱸的肥大細(xì)胞里分離出Piscidin抗菌肽，他們通過(guò)采用脂分子雙層的結(jié)構(gòu)分析和電生理實(shí)驗(yàn)研究了這個(gè)包括22個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子肽的抗菌機(jī)制，圓二色性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)譜Piscidin在水中是無(wú)組織的，但卻有1個(gè)高度緊密的alpha-helix，8～17個(gè)氨基酸殘基在微胞環(huán)境中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和親水區(qū)域，這個(gè)分子有兩親性的特性。這種結(jié)構(gòu)和那些能使細(xì)菌細(xì)胞通透性增強(qiáng)的陽(yáng)離子肽的結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二維的雙分子層多通道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同的濃度下會(huì)出現(xiàn)1個(gè)Ⅰ-Ⅴ曲線(xiàn)，而且非常明確的表明肽分子能使細(xì)菌細(xì)胞膜通透。這個(gè)孔形成的活力通過(guò)單通道實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了。離子通道的特性更加明確的表明了Piscidin通過(guò)螺旋的孔道結(jié)構(gòu)更能使細(xì)菌透化，而不是通過(guò)“桶-桶板（barrel-stave）模型”。A.Falco等人從鮭科魚(yú)類(lèi)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取了虹鱒β-防御素類(lèi)抗菌肽的順序稱(chēng)為c.mykiss βdefensin-1(omBD-1)，signal P3.0program分析發(fā)現(xiàn)，在omBD-1的19位后有1個(gè)假定的切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)后有1個(gè)含有41個(gè)氨基酸的前體肽和β-防御素共有的順序一樣，也有6個(gè)保守的cys殘基，它和從其它魚(yú)類(lèi)中分離到的β-防御素類(lèi)抗菌肽有85.7%的同源性，同人類(lèi)有34.9%的同源性；omBD-1有1個(gè)正2價(jià)的陽(yáng)離子，等電點(diǎn)為8，這有助于omBD-1與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合。

近年來(lái)的研究重點(diǎn)，在于向建立水生動(dòng)物免疫特異性cDNA文庫(kù)和表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）方面轉(zhuǎn)移，這將有助于發(fā)現(xiàn)更多的抗菌肽基因。Nam等地日本鰈魚(yú)類(lèi)的cDNA和ESTs文庫(kù)，從中鑒定了許多免疫相關(guān)基因，如Mx蛋白基因、補(bǔ)體基因、干擾素調(diào)節(jié)基因等；從2種白對(duì)蝦的ESTs中發(fā)現(xiàn)了44個(gè)免疫功能相關(guān)基因，全部免疫ESTs中，屬于抗菌肽的ESTs數(shù)量占總數(shù)量的60%以上?？梢?jiàn)抗菌肽的種類(lèi)數(shù)目非常大，在水生動(dòng)物中的分布也十分廣泛。