馮學(xué)明，冉多良

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊830002）

1 概述

布魯氏菌?。╞rucellosis）也被稱之為馬耳他熱、波浪熱以及地中海弛張熱等，是由布魯氏菌引起的一類嚴(yán)重威脅人畜健康的人畜共患病，以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征。自1886年英國醫(yī)生Bruce 首次在馬爾他島分離確診該病后，開始流行于全世界170 余個國家。近些年中國布魯氏菌病疫情呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢[1]。在一定程度上對當(dāng)?shù)鼐用裆硇慕】狄约氨镜匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。利用有效方式全面強化布魯氏病檢測防控以及新型研究疫苗的研發(fā)對于布病的防控意義重大。目前我國用于動物免疫的疫苗主要有牛種布魯氏菌A19 株弱毒疫苗，豬種布魯氏菌S2 株弱毒疫苗，羊種布魯氏菌S2 株弱毒疫苗，在研發(fā)的疫苗有基因工程疫苗等。

2 流行學(xué)特征

2.1 病原性特點

布魯氏菌(brucella)為革蘭氏陰性兼性細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌。根據(jù)布魯氏菌的流行病學(xué)特征、對宿主的親嗜性及基因結(jié)構(gòu)上的差異分成六種，羊種布魯氏菌 （Brucella melitensis）、牛種布魯氏菌（Brucella abortus）、豬種（Brucella suis）、沙林鼠種（Brucella neotomae）、犬種（Brucella canis）、綿羊；附睪種（Brucella ovis）。而已豬、牛、羊最為常見，羊種布魯氏菌病致病性最強。自然條件下有較強的抵抗力，可在土壤、水源、患病動物分泌物中存4 個月，強光暴曬4h 可殺滅細(xì)菌，但是對濕熱和常用化學(xué)消毒劑很敏感60℃30min、70℃5～10min 及一般消毒藥都可將其殺死。

2.2 流行特征

當(dāng)前已知有60 余種動物均可被視為儲存宿主，以豬、牛、羊為主要傳染源，其次是犬，發(fā)病或帶菌的野生動物也可作為傳染源。一般情況下先是野生動物或者家畜中傳播，然后才引起人畜共患，但迄今為止，我國沒有確切的證據(jù)證明人類宿主作為傳染源傳染給其他人，人作為傳染源意義并不大。布魯氏菌可經(jīng)消化道、呼吸道、生殖系統(tǒng)粘膜及皮膚等多種途徑傳播，通過接觸或食入感染動物的分泌物、毛發(fā)及污染的肉、奶等而感染。該疾病一年四季均可發(fā)生，但主要以家畜生產(chǎn)季節(jié)較多。在流行地區(qū)之內(nèi)，于晚春早夏發(fā)病的高峰季節(jié)會呈現(xiàn)出爆發(fā)式流行，且有著相當(dāng)明顯的職業(yè)性特征。接觸較多的病畜牧民、屠宰戶以及皮毛加工者，感染率明顯比其他群體要高。青壯年男性為主要從事畜牧生產(chǎn)業(yè)的群體，因此其接觸傳染源的機(jī)會也更多、感染機(jī)會更大，發(fā)病率也明顯高于女性。

3 疫苗研究進(jìn)展情況

目前，國內(nèi)普遍使用的畜用減毒活疫苗包含羊種布魯氏菌減毒疫苗株M5、豬種布魯氏菌減毒疫苗S2 以及牛用布魯氏菌疫苗A19，以上3類減毒活疫苗雖然有較好免疫效果，但其毒性大、無法區(qū)分自然感染和人工免疫的缺陷。

3.1 傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的疫苗株

3.1.1 牛種布魯氏菌病弱毒疫苗

S19 株疫苗是世界上第一個在家畜中使用最廣泛和最有效的疫苗。最初S19 是John Buck 在1923年從新澤西的一奶牛場分離培養(yǎng)成的，于20 世紀(jì)30年代在世界范圍內(nèi)推廣。1956年美國科學(xué)家對其進(jìn)行ery 基因敲除，使得毒力進(jìn)一步減弱，并將其更名為US19，目前，世界上大多數(shù)國家使用的疫苗都是ery 基因缺失株。我國是上個世紀(jì)50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)，被稱為A19 株，已使用60 多年，對我國布病的防控起到了關(guān)鍵性的作用。研究表明，我國使用的A19 株未被檢測到ery 基因的缺失，故推測是1956年前被廣泛使用的S19 株。A19 株對牛和綿羊有比較好的保護(hù)力，免疫期長達(dá)72 個月，對山羊免疫效果不理想，對豬無用，不能用于懷孕及泌乳的牛羊。

3.1.2 羊種布魯氏菌病弱毒疫苗

Rev.1.疫苗株是1953年美國學(xué)者Elberg 教授和Herzberg 教授等將羊種布魯氏菌6056 毒株在鏈霉素抗性培養(yǎng)基上不斷傳代得到的突變毒株，1957年首次被證實對山羊具有很好的保護(hù)作業(yè)。此后開始得到大規(guī)模應(yīng)用，也是OIE 推薦參考的動物疫苗之一，是目前用于小反芻獸動物最有效的疫苗?？梢圆捎闷は伦⑸浜驼衬ね緩矫庖?，免疫效果好，但毒性較強，正常劑量注射懷孕動物則會導(dǎo)致流產(chǎn)。

我國羊種布魯氏菌病活疫苗為M5 株，是哈爾濱獸醫(yī)研究所通過對將馬耳他布魯氏菌1 型和H2 強毒菌株M28 連續(xù)雞減毒獲得，氣霧免疫和皮下注射免疫效果較好，免疫期36 個月。該苗最大的缺點是菌株不穩(wěn)定，經(jīng)常會出現(xiàn)S 型到R型的變異，它是我國目前使用的動物疫苗中毒力最強的毒株。

3.1.3 豬種布魯氏菌病弱毒疫苗

豬種布魯氏菌病弱毒疫苗S2 株是1952年由中國獸醫(yī)藥品檢查所在豬流產(chǎn)胚胎中分離得到，該株與S19、Rev.1 和M5 相比，毒力較弱，對豬能夠產(chǎn)生更好的保護(hù)力，并且在牛羊豬等牲畜身上均有良好的免疫效果，并且口服也很少引起母畜的流產(chǎn)，具有更優(yōu)良的安全性。

3.2 基因工程疫苗

3.2.1 DNA 疫苗

布魯氏菌為一類胞內(nèi)寄生菌種。其能夠在一定程度上誘導(dǎo)機(jī)體生成特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，其對于布魯氏菌感染有著相當(dāng)重要的現(xiàn)實作用。文獻(xiàn)研究證實：布魯氏菌中的某些成分包含omp25、L7/L12 等等有著較為顯著的T 細(xì)胞抗原特點。以上成分所對應(yīng)的編碼基因能夠被視為布魯氏菌病DNA 疫苗研究重要選擇[5]。使用真核表達(dá)載體pcD-NA3.1 全面構(gòu)建出攜帶羊布魯氏菌omp31 基因的DNA 疫苗。相關(guān)研究結(jié)果證實，這種疫苗能夠全面誘導(dǎo)BALB/c 實驗小鼠有效的體液免疫應(yīng)答以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過免疫之后的小鼠對于羊布魯氏菌M16 菌株有著良好的保護(hù)效用。雖說DNA 疫苗有著安全性強，制備工藝簡單、方便運輸?shù)忍攸c。和其他疫苗相比，存在著免疫效果低下等弊端，尤其是單獨使用DNA 疫苗時，不容易誘導(dǎo)機(jī)體生成特異性免疫應(yīng)答。對此，需要開展深度研究解決這個問題[6]。

3.2.2 亞單位疫苗

布魯氏菌外膜蛋白胞質(zhì)結(jié)合蛋白L7/L12 蛋白等等有著相當(dāng)良好的抗原性。當(dāng)前對于布魯氏菌亞單位疫苗的研發(fā)，可以通過基因工程技術(shù)取得上述蛋白的編碼基因。在此之后和質(zhì)粒等表達(dá)載體實現(xiàn)重組，在適宜的宿主中高效表達(dá)。已取得數(shù)量眾多保護(hù)性肽段。使用上述肽段配合合適的佐劑可以制成亞單位疫苗。利用l7/22 所制備的亞單位疫苗，能夠有效的在急性期布魯氏菌病患者機(jī)體中誘導(dǎo)出有意義的Th1 型免疫應(yīng)答[8]。相較于傳統(tǒng)型疫苗，亞單位疫苗有著能夠使用血清學(xué)方法加以鑒別、成分單純以及安全性強等特征，此類疫苗也存在著單獨使用后免疫效果較低、生產(chǎn)工藝也較復(fù)雜，成本較高等弊端，很難應(yīng)用推廣。

3.2.3 基因缺失疫苗

通過基因工程技術(shù)，可以將布魯氏菌基因組內(nèi)相關(guān)獨立基因加以敲除、沉默或者替代等操作，進(jìn)而引起部分基因缺失制成的疫苗。其也被稱之為基因缺失疫苗。

有學(xué)者通過改造后螢火蟲熒光素酶報告基因LucNF+，全面替換布魯氏菌s19 疫苗之內(nèi)的Bmp26 基因部分片段。并以此為基礎(chǔ)，全面消除毒力基因，構(gòu)建起弱毒疫苗△s19/2。研究結(jié)果證實：報告LucNF+能夠在疫苗株△s19/2 中取得高效表達(dá)的效果[9]。

也有學(xué)者通過羊布魯氏菌疫苗菌株、Rev.1分別制成bp26 以及omp31 基因單基因或者雙基因缺失突變菌株[10]。研究結(jié)果證實，所取得的基因缺失突變菌株并不會對相關(guān)檢測造成不必要的干擾。其在小鼠機(jī)體中也可以起到誘導(dǎo)效應(yīng)，進(jìn)而體現(xiàn)出相關(guān)作用，其也能夠有效區(qū)別自然感染和人工免疫所造成的結(jié)果。當(dāng)前基因缺失的布魯氏菌病疫苗研發(fā)成為新熱點。

3.2.4 “無毒”布魯氏菌疫苗

截止到當(dāng)前，臨床還沒有發(fā)現(xiàn)森林鼠型布魯氏菌可以引發(fā)任何宿主發(fā)病。

有學(xué)者利用三類森林鼠型布魯氏菌進(jìn)行研究（其中包含過度表達(dá)超氧化物歧化酶類型以及經(jīng)過γ 射線處理之后非表達(dá)性胞質(zhì)蛋白PB26兩類重組菌株和正常化菌株）[11]。

視為疫苗免疫的實驗小鼠。結(jié)果證實，上述幾類疫苗均可以全面誘導(dǎo)實驗動物生成特異性抗體以及細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。該項研究還證實三類疫苗免疫之后，實驗動物對于諸如suis 330 幾類毒素攻擊效用就能體現(xiàn)出良好的抵抗作用。以上結(jié)果研究顯示，通過類似天然性無毒菌株，有望成為心事布魯氏菌疫苗研發(fā)的備選性材料。

4 布魯氏菌病疫苗的研究展望

目前我國布病疫情呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅了人和動物的健康安全，給我國畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是布病綜合防控中的重要措施，但由于現(xiàn)有的疫苗都存在不同的缺陷，難以有效地控制疫病的發(fā)生，并且部分疫苗的廣泛使用會干擾后期的診斷，給布魯氏菌病的防控造成一定的困難。但我們有理由相信，隨著我國科技技術(shù)的不斷發(fā)展，隨著對布魯氏菌病的不斷深入研究，研究更安全、穩(wěn)定、高效的新型疫苗并不會遙遠(yuǎn)，我相信，在政府管理部門和科研工作者的努力下，我國的布魯氏菌病疫情一定得以遏制。