江佳琦 陳曉輝 徐恩

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)于1973年由Beg等[1]及Carlson和Kim[2]首次發(fā)現(xiàn)。此后，AMPK一直被認(rèn)為是真核細(xì)胞的能量傳感器。近年來，AMPK在調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞生長、有絲分裂、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞極性、自噬、炎性反應(yīng)和免疫功能中的作用日益受到重視。AMPK普遍存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的組織和器官中，在腦內(nèi)也有表達(dá)。肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)、Ca2+/CaM-依賴蛋白激酶激酶β(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase β,CaMKKβ)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)或二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)/ATP比值升高等均可以激活A(yù)MPK，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝，從而提高機(jī)體應(yīng)對內(nèi)外環(huán)境變化的能力，維持細(xì)胞水平乃至整個(gè)機(jī)體的穩(wěn)定狀態(tài)[3]。AMPK作為能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，在腦缺血發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。作者就AMPK的分子生物學(xué)特征及其在腦缺血中的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述如下。

1 AMPK的分子生物學(xué)特征

1.1 AMPK的分子結(jié)構(gòu)

AMPK是一種異源三聚體蛋白，包含催化亞基α(α1、α2)、調(diào)節(jié)亞基β(β1、β2)和催化亞基γ(γ1、γ2、γ3)，α催化亞基C端與β亞基連接，β亞基的C端與γ亞基的N端結(jié)合形成12種不同組合的異源三聚體[4]。α催化亞基的N端含有激酶區(qū)域，也稱催化區(qū)，催化區(qū)中含有激活環(huán)、α-鉤狀結(jié)構(gòu)和自我抑制序列(auto-inhibitory domain,AID)3個(gè)重要結(jié)構(gòu)域。激活環(huán)絲氨酸(serine,Ser)/蘇氨酸(threonine,Thr)激酶區(qū)上保守的Thr172位點(diǎn)的磷酸化是AMPK活化所必需的[5]。Thr172位點(diǎn)磷酸化主要受上游激酶LKB1或CaMKKβ調(diào)控。α-鉤狀結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)激酶區(qū)和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)之間的互相交流，并抑制Thr172位點(diǎn)的去磷酸化[6]。AID調(diào)控激酶區(qū)域在非磷酸化的開放與磷酸化的關(guān)閉狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)激酶區(qū)域在非活化與活化或半活化狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換[7]。α催化亞基C端的功能為連接β亞基。β亞基N端含糖原結(jié)合域，可結(jié)合糖原，抑制AMPK的活性[8]。β亞基的C端可與γ亞基的N端結(jié)合。γ亞基有4個(gè)胱硫醚β合酶(cystathionine β-synthase,CBS)序列串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的4個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，即CBS1、CBS2、CBS3、CBS4。重復(fù)的2對組合(CBS1∶CBS2和CBS3∶CBS4)頭對頭聚合在每個(gè)象限，形成重復(fù)的盤狀結(jié)構(gòu)，并在中心形成4個(gè)潛在的配體結(jié)合晶體，即位點(diǎn)1～4[6]。其中，有效位點(diǎn)為1～3。位點(diǎn)1為緊密結(jié)合點(diǎn)，存在于CBS1和CBS2之間，與AMP、ADP、ATP的結(jié)合能力約為位點(diǎn)3的50倍。只有結(jié)合AMP時(shí)，上述位點(diǎn)才能發(fā)揮變構(gòu)效應(yīng)，激活A(yù)MPK[8]。位點(diǎn)2 通常不結(jié)合核苷酸[9]。位點(diǎn)3和4位于CBS3和CBS4之間。位點(diǎn)3 為微弱結(jié)合點(diǎn)，結(jié)合AMP或ADP后可抑制Thr172去磷酸化，活化AMPK[8]。位點(diǎn)4與AMP不可逆性結(jié)合，但其功能尚未明確[9]。

1.2 調(diào)控AMPK的機(jī)制

AMPK的表達(dá)受多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，其中能量應(yīng)激是調(diào)控AMPK的經(jīng)典機(jī)制。缺氧、缺血、糖酵解或線粒體損傷可導(dǎo)致ATP產(chǎn)生受抑制，而骨骼肌收縮則使ATP消耗過多，它們均可增加細(xì)胞內(nèi)的ADP/ATP比值，使ADP向ATP和AMP轉(zhuǎn)化增多，進(jìn)一步增加AMP/ATP比值[10]。在哺乳動(dòng)物中，AMP/ATP或ADP/ATP比值的增加使AMPK與AMP或ADP結(jié)合，促進(jìn)AMPK的Thr172位點(diǎn)磷酸化并抑制蛋白磷酸酶2A和2C對Thr172的去磷酸化作用，從而激活A(yù)MPK。由于AMP與AMPK結(jié)合引起的AMPK變構(gòu)激活能力是ADP的10倍以上，故AMP是能量應(yīng)激調(diào)節(jié)AMPK的主要機(jī)制[10-11]。此外，AMPK也受以下的3種機(jī)制調(diào)節(jié)。(1)磷酸化：在能量缺乏時(shí)，LKB1可以使AMPK Thr172位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)MPK[12]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多時(shí)，CaMKKβ亦可使AMPK的Thr172位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)MPK[11]。另有研究證實(shí)，蛋白激酶B可使AMPK α1亞基S485位點(diǎn)磷酸化，抑制AMPK的Thr172位點(diǎn)磷酸化，從而使AMPK失活[13]。最近的一項(xiàng)研究證明，蛋白激酶D1也能使AMPK α2亞基S491位點(diǎn)磷酸化，抑制AMPK活性[14]。(2)氧化：Zmijewski等[15]發(fā)現(xiàn)，在HEK293細(xì)胞中，H2O2可使AMPK α亞基上的C299/C304位點(diǎn)氧化和S谷胱甘肽化，從而激活A(yù)MPK。然而，在心肌細(xì)胞中，給予氧糖剝奪時(shí)，H2O2可誘導(dǎo)AMPK α亞基C130/C174氧化，從而抑制AMPK活性并破壞AMPK與上游激酶的相互作用[16]。上述證據(jù)表明，活性氧調(diào)節(jié)AMPK活性的作用機(jī)制仍存在爭議。(3)泛素化：睪丸黑素瘤相關(guān)抗原A3/6和三重模體蛋白28泛素連接酶復(fù)合體在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，使AMPK α1亞基泛素化并誘導(dǎo)AMPK降解[17]。Yan等[18]研究認(rèn)為，小泛素修飾蛋白E3連接酶活化的信號轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)錄激活子蛋白抑制劑4催化AMPK α1亞基的類泛素化，抑制AMPK活性。然而，也有研究表明，另一種小泛素修飾蛋白E3連接酶活化的信號轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)錄激活子蛋白抑制劑y特異性靶向結(jié)合AMPK β2亞基，使β2亞基類泛素化，從而激活A(yù)MPK[19]。

2 AMPK與腦缺血

2.1 AMPK抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)

有證據(jù)表明，AMPK參與的氧化應(yīng)激在大腦中起著關(guān)鍵作用。Choi等[20]通過體外混合培養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在氧糖剝奪1.5 h復(fù)氧5 h的條件下，磷酸化的AMPK(phospho-AMPK，p-AMPK)表達(dá)明顯減少，并在30 min時(shí)降至最低水平，之后緩慢升高。而激活A(yù)MPK后，乳酸脫氫酶釋放相對減少，氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞造成的損傷明顯減弱。而使用AMPK抑制劑compound C選擇性抑制AMPK活性后，乳酸脫氫酶釋放增多，神經(jīng)元損傷加重。作者進(jìn)一步觀察成年雄性Sprague-Dawley大鼠，發(fā)現(xiàn)在右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞1.5 h再灌注24 h后，AMPK的激活明顯縮小梗死和水腫的體積。而在上述同樣模型中，大鼠在缺血1.5 h再灌注3 d后，梗死區(qū)p-AMPK蛋白表達(dá)降低，活性氧和丙二醛升高，而激活A(yù)MPK后p-AMPK蛋白表達(dá)明顯升高，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2表達(dá)升高，活性氧和丙二醛明顯降低，醌氧化還原酶1和血紅素氧合酶1等抗氧化蛋白表達(dá)升高，提示AMPK可能通過轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2途徑抑制氧化還原反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。Kosuru等[22]的研究表明，在糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注模型中，AMPK通過抑制心臟氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。為進(jìn)一步證明AMPK對缺氧心肌的保護(hù)作用，在高糖條件下培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中加入compound C，再將心肌細(xì)胞暴露于缺氧45 min復(fù)氧2 h條件下，compound C明顯降低p-AMPK活性，從而降低AMPK的抗氧化應(yīng)激作用。這些證據(jù)表明，AMPK在缺血/缺氧腦損傷疾病中具有潛在的預(yù)防作用，提示AMPK是腦缺血/缺氧疾病中的關(guān)鍵和保護(hù)分子。

2.2 AMPK抑制炎性反應(yīng)

Chen等[23]證實(shí)激活A(yù)MPK可抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中，加入脂多糖可誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)，而加入AMPK的直接激動(dòng)劑ENERGI-F704則明顯增加p-AMPK表達(dá)，減少核因子κB(neuclear factor κB,NF-κB)核轉(zhuǎn)位進(jìn)而降低其蛋白質(zhì)水平，從而降低炎性介質(zhì)如白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)。上述結(jié)果表明，AMPK在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中通過NF-κB途徑抑制炎性反應(yīng)。而在Sprague-Dawley大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞 2 h再灌注48 h模型中，缺血后p-AMPK表達(dá)明顯降低。而激活A(yù)MPK可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的增加和抗炎因子的降低，從而在腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24]。另有研究結(jié)果表明，在成年Wistar大鼠行永久閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈，短暫夾閉雙側(cè)頸動(dòng)脈致全腦缺血30 min再灌注72 h的模型中，激活A(yù)MPK可降低大鼠海馬NF-κB、TNF-α、環(huán)氧合酶-2的表達(dá)水平，增加抗炎因子血紅素加氧酶-1及谷胱甘肽的表達(dá)水平，從而抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)，減輕腦缺血損傷[25]。而在C57BL/6小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞60 min再灌注3 d后，活化的AMPK可抑制梗死區(qū)缺血半暗帶中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性小體的激活和IL-1β、IL- 6、IL-18和TNF-α等的釋放。使用compound C可明顯逆轉(zhuǎn)AMPK的抗炎作用[26]。由此可見，AMPK的激活通過抑制腦缺血引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 AMPK激活自噬

自噬在營養(yǎng)或代謝壓力下被激活，通過更新功能失調(diào)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器維持組織穩(wěn)態(tài)。Jiang等[27]研究結(jié)果表明，給予雄性Sprague-Dawley大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞10 min腦缺血預(yù)處理后，梗死側(cè)的腦皮質(zhì)p-AMPK表達(dá)水平增加，并在梗死后12 h時(shí)達(dá)到高峰，同時(shí)發(fā)現(xiàn)梗死側(cè)的腦皮質(zhì)中自噬標(biāo)記輕鏈3Ⅱ(autophagy marker light chain 3Ⅱ,LC3-Ⅱ)蛋白變化趨勢與p-AMPK類似。筆者為進(jìn)一步證明p-AMPK與自噬的關(guān)系，在大鼠腦缺血預(yù)處理前5 min，經(jīng)腹腔注射單劑量compound C后，結(jié)果顯示，compound C明顯抑制LC3-Ⅱ表達(dá)，增加P62的表達(dá)。透射電鏡下也可觀察到抑制p-AMPK后，梗死側(cè)大腦皮質(zhì)中雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體減少，這些證據(jù)提示激活A(yù)MPK可以誘導(dǎo)自噬小體的產(chǎn)生。而在C57BL/6J小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞2 h再灌注12 h模型中，給予肢體遠(yuǎn)端缺血后處理可顯著增加p-AMPK表達(dá)水平，激活A(yù)MPK并顯著升高自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin-1及自噬相關(guān)蛋白7水平，降低sequestosome 1/P62的表達(dá)。而使用compound C后則逆轉(zhuǎn)這一過程，提示AMPK激活自噬的降解過程，從而誘導(dǎo)自噬[28]。而Liu等[29]在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，給予氧糖剝奪 6 h后，p-AMPK水平升高，免疫熒光可見自噬體與溶酶體融合增多，自噬通量提高，從而減輕神經(jīng)損傷，提高細(xì)胞活性；與對照組比較，使用慢病毒敲除AMPK α1亞基，神經(jīng)細(xì)胞自噬通量明顯被抑制，細(xì)胞活性降低。提示AMPK誘導(dǎo)自噬溶酶體的融合，從而保護(hù)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞免受氧糖剝奪誘導(dǎo)的損傷。這些研究表明，AMPK可以激活自噬，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的缺血耐受性，但AMPK激活自噬哪個(gè)階段，仍需進(jìn)一步研究。

2.4 AMPK減輕細(xì)胞凋亡

業(yè)已證實(shí)，AMPK與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控有關(guān)。在雄性Sprague-Dawley大鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，給予腦缺血預(yù)處理10 min后，梗死區(qū)腦皮質(zhì)中p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，TUNEL陽性細(xì)胞比例減少，皮質(zhì)梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損加重，提示激活A(yù)MPK可減輕細(xì)胞凋亡[27]。而Yang等[30]在雄性IRC小鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞60 min再灌注24 h模型中，活化的AMPK可以降低Bax 和caspase-3的mRNA水平，進(jìn)而減少二者的蛋白表達(dá)并增加Bcl-2的表達(dá)水平，從而減輕細(xì)胞凋亡。而使用compound C特異性抑制AMPK后，所得結(jié)果與上述相反，由此表明AMPK可減輕腦缺血后引起的細(xì)胞凋亡。另外，在C57BL/6小鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞60 min再灌注24 h后，梗死側(cè)大腦皮質(zhì)中caspase-3、cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)升高，腦梗死體積增大，神經(jīng)功能損傷加重，而激活A(yù)MPK后，梗死體積明顯縮小，神經(jīng)功能改善。為進(jìn)一步探究AMPK減輕細(xì)胞凋亡的機(jī)制，研究人員在體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞中，應(yīng)用95% N2/5% CO2缺氧處理3 h后復(fù)氧6 h模擬缺血性損傷，發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK可使糖原合成酶激酶-3β絲氨酸-9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，降低caspase-3和Bax/Bcl-2的表達(dá)，從而抑制PC12細(xì)胞凋亡[31]。在新生10 d大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并低氧2.5 h模型中，激活A(yù)MPK可以降低cleaved caspase-3表達(dá)，減少Fluoro-Jade C和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能，提示AMPK在缺血缺氧性腦病中起神經(jīng)保護(hù)作用[32]。以上研究表明，AMPK抑制神經(jīng)元凋亡是未來腦缺血防治中有潛力的治療策略之一。

2.5 AMPK促進(jìn)血管生成

在C57BL/6N小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞 60 min再灌注24 h后，利用熒光標(biāo)記的凝集素評估血管生成，結(jié)果顯示小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后血管明顯減少，而持續(xù)3周給予AMPK激活劑二甲雙胍后，血管分支明顯增多，神經(jīng)功能缺損明顯改善。研究人員進(jìn)一步利用AMPK α2基因敲除小鼠使AMPK的活性抑制，結(jié)果顯示能夠逆轉(zhuǎn)AMPK可促進(jìn)血管生成作用，加重腦缺血損傷[33]。Wu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在Sprague-Dawley大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞90 min再灌注24 h模型中，免疫熒光染色可見缺血后CD31、內(nèi)皮特異性標(biāo)志物血管性血友病因子明顯下降，提示缺血后血管密度降低。而激活A(yù)MPK可促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活化，血管密度恢復(fù)且有所增加，改善腦血流。而使用特異性siRNA沉默AMPK后，磷酸化的eNOS蛋白表達(dá)水平降低。以上研究結(jié)果表明，AMPK可能通過eNOS途徑促進(jìn)血管生成，從而促進(jìn)腦缺血后的功能恢復(fù)。在體外原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中，激活A(yù)MPK可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力并誘導(dǎo)管狀分支形成；而沉默AMPK α2亞基則可抑制管狀分支形成和遷移。在體內(nèi)C57BL/6J小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，激活A(yù)MPK亦可觀察到CD31+/Ki67+細(xì)胞數(shù)量增加，提示血管新生增多，免疫熒光可觀察到缺血邊緣區(qū)血管生成增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞中p-AMPK α2的陽性細(xì)胞增多，從而減輕神經(jīng)功能損害[35]。激活A(yù)MPK有助于促進(jìn)腦缺血后血管生成，減輕腦缺血損傷，改善神經(jīng)功能。

AMPK是一種高度保守的Ser/Thr蛋白激酶，是細(xì)胞重要的能量感受器和調(diào)節(jié)器，也是調(diào)節(jié)生物能量代謝的關(guān)鍵分子。腦缺血后AMPK可被激活，通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)、激活自噬、減輕細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。隨著對AMPK研究的深入，AMPK可能會(huì)成為缺血性卒中治療的一個(gè)有前景的新靶點(diǎn)。