徐 佳，王 萱，游 燕，薛華丹，王 勤，王士闐，金征宇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1放射科 2病理科，北京 100730

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵且必經(jīng)的過程，并最終導(dǎo)致終末期肝病[1]，對(duì)肝纖維化的早期合理診斷對(duì)改善慢性肝病預(yù)后具有重要意義[2-3]。目前，肝穿刺活檢仍是肝纖維化診斷及分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而其為有創(chuàng)性操作，不利于長期隨訪、觀察疾病進(jìn)展和評(píng)價(jià)藥物療效。現(xiàn)有的肝纖維化評(píng)價(jià)替代技術(shù)包括實(shí)驗(yàn)室血生化指標(biāo)、超聲彈性成像、CT、磁共振等[4-6]，但尚未有能夠真正代替肝穿刺活檢的檢查手段。釓塞酸二鈉(gadolinium ethoxybenzyl diethylene-triamine-pentaacetic-acid，Gd-EOB-DTPA)是一種肝臟特異性的磁共振對(duì)比劑[7]。在肝臟纖維化過程中，肝臟的灌注、血管通透性、細(xì)胞外彌散、肝細(xì)胞功能及轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)均會(huì)發(fā)生變化，而Gd-EOB-DTPA具有血池對(duì)比劑及肝細(xì)胞對(duì)比劑的雙重特性，在肝臟顯影的動(dòng)脈期和門脈期，主要分布于血管內(nèi)或血管外細(xì)胞外間隙中，反映肝臟灌注信息在肝膽期(約注射對(duì)比劑20 min后)被正常肝細(xì)胞特異性攝取的特性，提供肝細(xì)胞功能信息，于是，Gd-EOB-DTPA動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振就具備了同時(shí)定量分析肝臟灌注和肝細(xì)胞功能的潛力[8-9]。因此，本研究通過構(gòu)建肝毒性肝纖維化動(dòng)物模型，應(yīng)用Gd-EOB-DTPA動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像技術(shù)，以病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，研究肝纖維化進(jìn)程中灌注和多期肝膽期影像學(xué)特征與纖維化分級(jí)的相關(guān)性。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組采用雄性SD大鼠60只，6～7周齡，體重180～220 g，購于維通利華公司。將60只大鼠使用簡單隨機(jī)分組法分為正常對(duì)照組(n=15)、實(shí)驗(yàn)組1(n=15)、實(shí)驗(yàn)組2(n=15)、實(shí)驗(yàn)組3(n=15)。

動(dòng)物模型建立采用40%四氯化碳溶液腹腔注射法構(gòu)建大鼠病毒性肝纖維化模型，劑量為3 μl/g體重，每周2次，分別注射4周(實(shí)驗(yàn)組1)、8周(實(shí)驗(yàn)組2)、12周(實(shí)驗(yàn)組3)，以制備不同程度的肝纖維化模型。對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。

血透明質(zhì)酸測定4組大鼠于掃描前2天采用剪尾尖采血法取血(每只約1 ml)，采血前停止腹腔注射四氯化碳1周，以避免肝臟急性期炎癥反應(yīng)對(duì)血生化指標(biāo)的影響。應(yīng)用透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)定量測定試劑盒測定血漿HA含量。

磁共振掃描掃描采用臨床3.0T磁共振掃描設(shè)備(Siemens MAGNETOM Skyra 3.0T，德國)及16通道腕關(guān)節(jié)線圈。對(duì)比劑采用釓塞酸二鈉稀釋10倍(0.025 mmol/ml)，注射劑量不變，即實(shí)際注射的對(duì)比劑體積為3 μl/g大鼠體重。掃描前用2%戊巴比妥鈉溶液對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定，經(jīng)尾靜脈置入留置針。

掃描序列包括平掃、快速動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描及肝膽期多期掃描。平掃包括冠狀位T2加權(quán)快速自旋回波序列(T2-weighted turbo spin-echo，T2 TSE)[重復(fù)時(shí)間(repetition time，TR)=3770 ms，恢復(fù)時(shí)間(echo time，TE)=62 ms，視野(field of view，F(xiàn)ov)=95 mm×160 mm，層厚=2.0 mm]、軸位T2 TSE (TR=5000 ms，TE=62 ms，F(xiàn)ov=80 mm×160 mm，層厚=2.0 mm)、軸位T1 TSE (TR=800 ms，TE=11 ms，F(xiàn)ov=80 mm×160 mm，層厚=2.0 mm)?？焖賱?dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描采用快速TWIST-VIBE序列(TR=6.22 ms，TE=2.46 ms，F(xiàn)ov=90 mm×200 mm，層厚=2.0 mm)，3s/期，共連續(xù)掃描60期，于第3期掃描開始時(shí)通過尾靜脈置管快速團(tuán)注Gd-EOB-DTPA對(duì)比劑；肝膽期掃描采用單期TWIST-VIBE序列，于注射對(duì)比劑后每隔5分鐘成像1次，共12期(60 min)。掃描全部時(shí)長約為80 min。

圖像處理分析采用Siemens多功能圖像后處理工作站MMWP上的Tissue 4D軟件，采用Tofts普適動(dòng)力學(xué)模型處理動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast enhanced-magnetic resonance imaging,DCE-MRI)數(shù)據(jù)，通過在肝右葉勾畫感興趣區(qū)域(圖1A)得到DCE的相對(duì)強(qiáng)化率-時(shí)間曲線(圖1B)，確認(rèn)DCE掃描成功，可進(jìn)行下一步處理，進(jìn)一步得到容量轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(transfer constant，Ktrans)、速率常數(shù)(reverse rate constant，kep)、血管外細(xì)胞外間隙體積百分?jǐn)?shù)(extravascular extracellular volume fraction，Ve)及初始曲線下面積(initial area under curve，iAUC)偽彩圖。選取肝臟最大層面及其上下各一層面共3個(gè)層面，于每個(gè)層面的右半肝勾勒感興趣區(qū)域(圖1A)，面積0.3～0.5 cm2，注意避開血管區(qū)，取平均值得到肝臟定量灌注參數(shù)Ve、Ktrans、Kep及iAUC。

采用動(dòng)態(tài)均值曲線工具包，選取肝臟最大層面及其上下各一層面共3個(gè)層面，于每個(gè)層面的右半肝勾勒感興趣區(qū)域，繪制肝臟信號(hào)強(qiáng)度(signal intensity，SI)-時(shí)間特征曲線(圖1C)，取3個(gè)層面信號(hào)強(qiáng)度平均值，獲得半定量灌注參數(shù)包括達(dá)峰時(shí)間(time of maximum relative enhancement，Tmax)、最大相對(duì)強(qiáng)化率(maximum relative enhancement，REmax)。

測定肝膽期內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)(打藥后5～60 min)肝臟SI，計(jì)算肝膽期內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)肝臟的相對(duì)強(qiáng)化率(relative enhancement，RE)[RE=(肝膽期SI-平掃SI)/平掃SI)]。繪制肝膽期肝臟RE-時(shí)間曲線，計(jì)算獲得3 min與60 min的RE差值(RE下降=RE3 min-RE60 min)。由于Gd-EOB-DTPA的消除過程學(xué)符合一級(jí)動(dòng)物消除力學(xué)，對(duì)各期RE進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線擬合，得到Gd-EOB-DTPA消除曲線，計(jì)算獲得肝臟信號(hào)降低一半的時(shí)間(elimination half-life of RE，TRE1/2)。

病理學(xué)分析完成磁共振掃描后，將大鼠過量麻醉處死后立即解剖，取部分右葉肝臟用于病理學(xué)分析，采用HE染色及Masson染色，利用METAVIR分期系統(tǒng)進(jìn)行病理學(xué)分期(F0：無纖維化；F1：匯管區(qū)纖維化；F2：少量的匯管區(qū)-中央靜脈纖維橋或纖維分隔；F3：大量的匯管區(qū)-中央靜脈纖維橋或纖維分隔；F4：早期肝硬化)。本研究定義F1～F2期為輕度肝纖維化，F(xiàn)3～F4期為重度肝纖維化。

圖1肝右葉感興趣區(qū)位置(紅圈1)(A)及生成的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)相對(duì)強(qiáng)化率-時(shí)間曲線(B)、多期肝膽期平均信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線(C)

Fig1Images indicating the region of interest (red circle 1) drawn in the right liver lobe (A)，and the calculated relative enhancement-time curve of dynamic contrast enhanced phase (B)，and mean signal intensity-time curve of multiple hepatobiliary phase (C)

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0軟件，資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(One way ANOVA)比較3組肝纖維化期別的功能磁共振成像參數(shù)(不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)強(qiáng)化率、TRE1/2、Ktrans、Ve等)、血生化指標(biāo)(HA)差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并運(yùn)用多重比較(LSD)，進(jìn)一步檢驗(yàn)組對(duì)之間差異是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)計(jì)算相關(guān)參數(shù)與纖維化分期的相關(guān)性。運(yùn)用受試者工作曲線(receiver-operator curves，ROC)分析磁共振成像參數(shù)對(duì)診斷肝纖維化分期的敏感性和特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

病理結(jié)果27只大鼠于四氯化碳注射模型制備中死亡，2只大鼠于麻醉時(shí)死亡，最終31只大鼠成功完成磁共振檢查及病理學(xué)檢查。其中病理分期為正常的10只、輕度肝纖維化10只、重度肝纖維化11只。HE及Masson染色分別顯示匯管區(qū)無纖維化(F0)，匯管區(qū)纖維組織輕度增生(F1)，匯管區(qū)-中央靜脈間橋接纖維間隔形成(F3)，早期肝硬化、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、纖維間隔形成(F4)(圖2)。

灌注參數(shù)與肝纖維化分級(jí)隨著肝纖維程度的加重，Ktrans、Ve、iAUC呈下降趨勢(相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.631，P=0.002；r=-0.503，P=0.017；r=-0.446，P=0.037)。Ktrans和Ve組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.011，P=0.005；F=4.656，P=0.023)，正常組和重度肝纖維化組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.009)。Tmax組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.633，P=0.005)，重度肝纖維化組的Tmax顯著長于輕度肝纖維化組和正常組(P=0.004，P=0.005)。REmax組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。從正常到重度肝纖維化，Ktrans，Ve和iAUC呈下降趨勢(圖3)。

F0：正常匯管區(qū)，無纖維化表現(xiàn)(×400)；F1：匯管區(qū)纖維組織輕度增生，匯管區(qū)略擴(kuò)大(×200)；F3：匯管區(qū)-中央靜脈間橋接纖維間隔形成(×200)；F4：早期肝硬化，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔形成(×40)

F0：normal liver parenchyma，without liver fibrosis (×400)；F1：enlargement of portal tract with rare septa formation (×200)；F3：fibrous septa bridging portal triads and central veins(×200)；F4：early cirrhosis，nodules of liver parenchyma separated by thick fibrous bands(×40)

圖2不同肝纖維化分級(jí)的HE及Masson染色結(jié)果

Fig2HE and Masson staining of liver tissues at different liver fibrosis stages

表1 不同病理學(xué)分期下灌注參數(shù)比較Table 1 Comparisons of perfusion parameters in different liver fibrosis

Ktrans：轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)；kep：速率常數(shù)；Ve：血管外細(xì)胞外間隙體積百分?jǐn)?shù)；iAUC：初始曲線下面積；Tmax：達(dá)峰時(shí)間；REmax：最大相對(duì)強(qiáng)化率；與正常比較，aP=0.047，bP=0.001，cP=0.009，dP=0.005；與輕度纖維化比較，eP=0.004

Ktrans：transfer constant；Kep：reverse rate constant；Ve：extravascular extracellular volume fraction；iAUC：initial area under curve；Tmax：time of maximum relative enhancement；REmax：maximum relative enhancement；aP=0.047，bP=0.001，cP=0.009，dP=0.005 compared with normal；eP=0.004 compared with mild fibrosis

圖3正常組和重度肝纖維化組的Ktrans、Kep、Ve和iAUC偽彩圖

Fig3Ktrans，Kep，Veand iAUC of normal group and advanced fibrosis group

在區(qū)分正常與輕、重度肝纖維化時(shí)，Ktrans、Ve的ROC曲線下面積分別為0.857(95%CI=0.689～0.989，P=0.006)、0.813(95%CI=0.607～0.939，P=0.017)；Ktrans臨界值小于0.647時(shí)，區(qū)分輕度肝纖維化與正常肝臟的敏感性與特異性分別為66.7%和66.7%，Ve界值小于0.395時(shí)，Ve的敏感性與特異性分別為88.9%和83.3%。在診斷重度肝纖維化時(shí)，Ktrans、iAUC的ROC曲線下面積分別為0.821(95%CI=0.646～0.995，P=0.012)、0.761(95%CI=0.548～0.973，P=0.042)；Ktrans臨界值小于0.525時(shí)，診斷重度肝纖維化的敏感性與特異性分別為80.0%和78.9%，iAUC臨界值小于13.77時(shí)，診斷重度肝纖維化的敏感性與特異性分別為80.0%和73.7%。

多期肝膽期參數(shù)與肝纖維化分級(jí)不同病理學(xué)分級(jí)的多期肝膽期參數(shù)包括在3、 20、 45、 50、 55 和60 min的RE值、RE下降和 TRE1/2。RE45 min、RE50 min和RE55 min組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.994，P=0.030；F=5.276，P=0.020；F=5.189，P=0.002)，重度肝纖維化組的RE45 min、RE50 min和RE55 min顯著高于輕度肝纖維化組(P=0.011，P=0.007，P=0.001)。重度肝纖維化組的RE55 min和RE60 min顯著高于正常組(P=0.006，P=0.014)。RE3 min和RE20 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著肝纖維程度的加重，RE下降呈減少趨勢(r=-0.616，P=0.006)，TRE1/2呈延長趨勢(r=0.513，P=0.003)。TRE1/2、RE下降組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.493，P=0.010；F=5.343，P=0.014)，重度肝纖維化組的TRE1/2顯著長于輕度和正常組(P=0.008，P=0.008)，RE下降顯著少于輕度和正常組(P=0.012，P=0.007)(表2)。

HA與肝纖維化分期隨著肝纖維化程度的加重，HA逐漸升高，正常、輕度纖維化、重度纖維化組的HA值分別為(103.1±16.8) ng/ml、(136.3±38.7) ng/ml、(170.9±53.8) ng/ml，輕度、重度纖維化組顯著高于正常組(P=0.027，P=0.002)，輕度、重度肝纖維化組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同病理學(xué)分期下多期肝膽期參數(shù)比較

RE3 min：3 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE20 min：20 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE45 min：45 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE50 min：50 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE55 min：55 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE60 min：60 min時(shí)的相對(duì)強(qiáng)化率；RE下降=RE3 min-RE60 min；TRE1/2：相對(duì)強(qiáng)化率減半的時(shí)間；與正常比較，aP=0.006，bP=0.014，cP=0.007，dP=0.008；與輕度纖維化比較，eP=0.011，fP=0.007，gP=0.001，hP=0.012，iP=0.008

RE3 min：relative enhancement at 3 minutes；RE20 min：relative enhancement at 20 minutes；RE45 min：relative enhancement at 45 minutes；RE50 min：relative enhancement at 50 minutes；RE55 min：relative enhancement at 55 minutes；RE60 min：relative enhancement at 60 minutes；REchange=RE3 min-RE60 min；TRE1/2：elimination half-life of relative enhancement；aP=0.006，bP=0.014，cP=0.007，dP=0.008 compared with normal；eP=0.011，fP=0.007，gP=0.001，hP=0.012，iP=0.008 compared with mild fibrosis

討 論

肝纖維化伴隨著血管通透性、細(xì)胞外擴(kuò)散和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)變化，Gd-EOB-DTPA作為一種肝特異性對(duì)比劑，具有一定程度上反映這種變化的潛力[7]。Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI定量評(píng)價(jià)肝纖維化是近年研究的熱點(diǎn)，在診斷肝纖維化方面，具有無創(chuàng)、利于隨訪等優(yōu)勢。既往研究表明，注射對(duì)比劑后20 min肝膽期相對(duì)強(qiáng)化率隨著肝臟正常、肝纖維化、早期肝硬化的進(jìn)展，呈下降趨勢，具有定量評(píng)價(jià)肝纖維化的能力[10-15]，但對(duì)灌注參數(shù)以及多期肝膽期變化特征的研究尚有限[16]。本研究探討了Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)磁共振的快速動(dòng)態(tài)增強(qiáng)期的灌注參數(shù)，以及肝膽期信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化特點(diǎn)相關(guān)參數(shù)對(duì)于肝纖維化分期診斷的價(jià)值。

本研究顯示，隨著肝纖維化程度進(jìn)展，灌注參數(shù)Ktrans、Ve、iAUC均呈下降趨勢。Ktrans、Ve、iAUC分別代表單位時(shí)間內(nèi)每單位體積組織中從血液進(jìn)入血管外細(xì)胞外間隙的對(duì)比劑量、單位體積組織內(nèi)血管外細(xì)胞外間隙的體積以及對(duì)比劑流入肝臟的量，其原因可能為，隨著肝纖維化程度的加重，細(xì)胞外基質(zhì)沉積、內(nèi)皮孔隙減小消失，血流減慢，血管通透性減低，進(jìn)而使得對(duì)比劑的擴(kuò)散減慢，在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)比劑流入肝臟的量減少。Zhang等[16]對(duì)大鼠肝纖維化模型研究顯示，Ktrans、iAUC在重度肝纖維化中最大、在正常組中最小。本研究結(jié)果與前人結(jié)果類似，但既往研究中Ve組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能為肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)沉積使得單位體積組織內(nèi)血管外細(xì)胞外間隙的體積減小。也有既往研究得到不同結(jié)果，隨著肝纖維程度增加，iAUC表現(xiàn)為下降趨勢(與本研究結(jié)果類似)，但Ktrans則表現(xiàn)為升高趨勢[17]；對(duì)于肝纖維化灌注參數(shù)的變化尚無定論。此外，半定量灌注參數(shù)分析結(jié)果顯示，隨著肝纖維化程度的加重，REmax逐漸減低，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)逐漸延長。該結(jié)果與定量灌注參數(shù)結(jié)果相印證，兩組參數(shù)共同提示肝纖維化程度加重，對(duì)比劑流入量減低、速度減慢。Tsuda等[18]利用大鼠脂肪性肝纖維化模型研究顯示，隨著其纖維化程度的進(jìn)展，Tmax值延長，與本研究結(jié)果相符。

本研究顯示，不同病理學(xué)分級(jí)中，肝膽期信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度肝纖維化組在較晚肝膽期(45 min、50 min、55 min和60 min)的相對(duì)強(qiáng)化率顯著高于輕度或?qū)φ战M，提示重度纖維化組在這些時(shí)點(diǎn)對(duì)比劑在肝細(xì)胞內(nèi)滯留量較大。其可能的解釋為，肝纖維化可導(dǎo)致肝細(xì)胞功能的下降：一方面體現(xiàn)為肝細(xì)胞對(duì)于對(duì)比劑攝取能力的減低，如既往研究所示，20 min肝膽期相對(duì)強(qiáng)化減低；一方面體現(xiàn)為肝細(xì)胞對(duì)于對(duì)比劑排泄能力的減低，即本研究結(jié)果所示。此外，本研究顯示，重度肝纖維化組的對(duì)比劑減半時(shí)間(TRE1/2)更長、RE變化(REmax-RE60 min)較少，共同提示在重度肝纖維化中對(duì)比劑排泄減慢，在肝膽期較晚時(shí)間點(diǎn)上，更多的對(duì)比劑滯留在肝細(xì)胞內(nèi)。已有研究顯示，隨著肝纖維化程度加重，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽和多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)量降低[19-20]，多藥耐藥相關(guān)蛋白是位于肝細(xì)胞膽管面的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其減低可能導(dǎo)致對(duì)比劑排出能力減低，這也許是能夠解釋本研究發(fā)現(xiàn)的分子蛋白學(xué)機(jī)制。

本研究采用多期肝膽期并得到晚期肝膽期參數(shù)對(duì)于診斷肝纖維化的潛在價(jià)值，對(duì)晚期肝膽期的探討提供了另一個(gè)可能用于定量評(píng)價(jià)肝纖維化的角度，即不僅是對(duì)比劑的攝取(常規(guī)的20 min肝膽期)，對(duì)比劑排泄的評(píng)估也具有潛在應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)掃描時(shí)間較長、不利于臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的問題，可考慮在實(shí)際應(yīng)用中，用分次掃描的方法減少占用機(jī)時(shí)。

本研究存在一些局限性。首先，樣本量相對(duì)較小，并非均勻分布在F0～F4期，所以統(tǒng)計(jì)時(shí)將病例分為了正常(F0)、輕度(F1～F2)和重度(F3～F4)組；進(jìn)一步研究有待增大樣本量。其次，本研究采用的是單輸入Tofts模型，而肝臟是動(dòng)脈、門脈雙血供器官，采用雙輸入模型更加符合肝臟的生理狀態(tài)。但由于全部樣本均采用同一方法計(jì)算數(shù)據(jù)，可將模型擬合的不足視為系統(tǒng)誤差，不同組間計(jì)算值具有可比性，既往也有肝纖維化研究采用這一模型[16-17]。

綜上，本研究提示Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI灌注參數(shù)與多期肝膽期強(qiáng)化參數(shù)對(duì)于肝纖維化的診斷及分級(jí)具有一定價(jià)值。