許 瑩，田 虎，于 劍，程佳林，趙玉成

1山東大學附屬山東省千佛山醫(yī)院普外科，濟南 250014 2泰山醫(yī)學院研究生學院，山東泰安 271000

特洛細胞第1次被發(fā)現(xiàn)并進行命名是由Popescu在科研過程中無意發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于普通間質細胞、卻又來源于間葉組織的細胞時完成的，距今已有30余年[1]。在這30年里，國內外大量科研團隊從特洛細胞存在的可能性、檢測細胞可能表達的生物免疫標志物、3D透視電鏡下的形態(tài)以及可能與其周圍細胞存在的相關聯(lián)系等方面進行了深入的研究，研究顯示特洛細胞廣泛存在于生物體的各個組織中，如存在于人體的心臟[2]、腎臟[3]、皮膚[4]、子宮等系統(tǒng)[5]，肺臟[6]、大腸[7]、肝臟[8]等幾乎所有的空腔臟器和實質臟器中，而且還存在于除人類以外的哺乳動物體內[9-18]。在某些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也同樣伴隨著特洛細胞的改變，如目前已明確的在心肌梗死心肌組織中，特洛細胞作為一種具有類似于纖維細胞功能的間質細胞在心肌梗死帶邊緣形成三維立體框架結構為新生心肌細胞提供構建的網(wǎng)狀結構[19]。ApoE基因敲除小鼠作為經(jīng)典的用于動脈血管粥樣硬化研究的動物模型已成熟地被應用于血脂異常等疾病的研究過程中[20]，此種小鼠在繁育的過程中被人為地敲除了部分細胞核內DNA基因，導致小鼠先天性缺乏ApoE基因，并在高脂飲食的情況下使動脈血管壁更容易產(chǎn)生粥樣炎癥性斑塊，較正常小鼠在同等高脂飲食條件下形成動脈粥樣硬化的時間明顯縮短，因此成為臨床研究動脈粥樣硬化疾病的經(jīng)典動物模型，而且也是在全世界范圍內得到公認的動物模型。特洛細胞作為近年熱門的研究方向，雖然已經(jīng)在正常小鼠體內的多器官中明確證實存在特洛細胞，而且可能參與了部分疾病的發(fā)生發(fā)展過程，但在ApoE-/-小鼠形成動脈粥樣硬化的過程中是否參與疾病發(fā)生發(fā)展的過程，依然缺乏基礎實驗的根據(jù)。本研究作為課題組研究的首批實驗結果，對特洛細胞在ApoE-/-小鼠心臟、肝臟及腎臟3大主要器官中的形態(tài)學差異進行系統(tǒng)的研究總結，為接下來的課題研究提供堅實的理論基礎。

材料和方法

獲取動物標本選取由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的ApoE基因敲除小鼠10只(No. 11400700287821)，雄性，無特定病原體級別，體重62 g，高脂飲食2周。小鼠飼養(yǎng)于山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學研究中心動物實驗室內，室溫22 ℃，相對濕度55%，鼠籠大小為80 cm×50 cm×45 cm(可保證小鼠活動自由，飲食飲水自由)。應用10%水合氯醛注射液對小鼠進行腹腔內灌注麻醉，根據(jù)0.04 ml/g水合氯醛為單位劑量計算小鼠麻醉藥物使用總量。麻醉成功后將小鼠放置于解剖臺上，固定四肢，常規(guī)消毒鋪巾，先取腹部正中切口快速切取腎臟組織、肝臟組織，然后打開胸腔取心臟組織，將以上組織放入室溫下含有4%多聚甲醛的標本固定液中，固定標本24 h。隨后將組織用石蠟包埋，切片，備行免疫組織化學。上述動物實驗已通過山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學研究中心倫理委員會的備案及同意(倫理號為：倫審字S0090號)。

免疫組織化學石蠟切片脫蠟至水：依次將切片(病理切片機出自上海徠卡儀器有限公司，RM2016)放入二甲苯和無水乙醇脫蠟并應用蒸餾水水洗(脫水機出自武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J)?？乖迯停航M織切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液(pH6.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，自然冷卻后將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次(渦旋混合器和掌上離心機出自谷歌生物公司，MX-FMX/D1008E)。血清封閉：在組化圈內滴加3%牛血清白蛋白均勻覆蓋組織(組化筆出自Gene tech公司，GT1001)，室溫封閉30 min。加一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(CD34，ABCAM公司，AB81289，稀釋比為1∶3000；CD117，Servicebio公司，GB11073，稀釋比為1∶500；PDGFR，Servicebio公司，GB11261，稀釋比為1∶200；CD28，ABCAM公司，AB203084，稀釋比為1∶200)，隨后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗，Servicebio公司，G23303，稀釋比為1∶200)覆蓋組織，室溫孵育50 min。辣根過氧化氫酶顯色：在圈內滴加新鮮配制的辣根過氧化氫酶顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色。復染細胞核：Harris蘇木素復染細胞核。顯微鏡鏡檢(1～400倍任意放大掃描，顯微鏡出自CIC公司，XSP-C204)，并進行圖像采集。免疫組織化學染色分析根據(jù)染色光密度對陽性標記分為3種等級，分別為弱(+)、中(++)、強(+++)，相對應的顏色變化為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒、褐黃色粗顆粒。圖像選取過程中以盡可能選取強陽性染色為原則。

結 果

心肌組織在ApoE-/-小鼠的心肌組織中，通過免疫組織化學的方法可以清晰地看到特洛細胞的形態(tài)結構：不規(guī)則的胞體和多條細長的串珠樣、偽足樣結構。特洛細胞存在于心肌細胞之間，根據(jù)不同的心肌細胞的走形表現(xiàn)出不同的形態(tài)，相鄰特洛細胞之間由細長的Telopodes相聯(lián)系，形成類似于網(wǎng)狀結構的分布現(xiàn)象。選取CD34、CD117和CD28 3種免疫組織化學生物指標對心肌細胞進行單標染色后，結果顯示心肌組織內特洛細胞表達CD34+、CD117+、CD28+(圖1～3)。

心臟組織中的特洛細胞對CD34陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

CD34-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖1心肌組織特洛細胞免疫組織化學CD34+單染(×400)

Fig1Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in myocardium tissue (×400)

心臟組織中的特洛細胞對CD117陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

CD117-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖2心肌組織特洛細胞免疫組織化學CD117+單染(×400)

Fig2Single immunohistochemical staining for CD117-positive Telocytes in myocardium tissue (×400)

心臟組織中的特洛細胞對CD28陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

CD28-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖3心肌組織特洛細胞免疫組織化學CD28+單染(×412)

Fig3Single immunohistochemical staining for CD28-positive Telocytes in myocardium tissue(×412)

肝臟組織在ApoE-/-小鼠的肝臟組織中，同樣可以觀察到特洛細胞的形態(tài)結構:不規(guī)則的胞體和數(shù)條Telope的串珠樣、偽足樣結構。選取CD34、CD117和血小板衍生生長因子受體-α(plateled-derived growth factor receptor-α，PDGFR-α)3種免疫組織化學生物指標對肝臟組織進行單標染色，結果顯示肝臟組織內特洛細胞表達CD34+、CD117+、PDGFR-α+。CD117陽性表達和PDGFR-α陽性表達的特洛細胞廣泛分布在肝組織內，其中PDGFR-α陽性表達的特洛細胞僅表達Telopode，而特洛細胞胞體未顯示陽性染色；CD34陽性表達的特洛細胞在肝臟組織內的分布有所差異，圍繞在毛細肝管周圍的特洛細胞明顯多于肝細胞之間的特洛細胞數(shù)量，且肝細胞之間的特洛細胞之間并未表現(xiàn)出明顯的三維網(wǎng)狀支架結構(圖4～6)。

肝臟組織中的特洛細胞對CD117陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

CD117-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖4肝組織特洛細胞免疫組織化學CD117+單染(×423)

Fig4Single immunohistochemical staining for CD117-positive Telocytes in hepatic tissue (×423)

肝臟組織中的特洛細胞對CD34陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

CD34-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖5肝組織特洛細胞免疫組織化學CD34+單染(×400)

Fig5Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in hepatic tissue (×400)

PDGFR-α：血小板衍生生長因子受體-α

PDGFR-α：plateled-derived growth factor receptor-α

肝臟組織中的特洛細胞對PDGFR-α陽性表達，表現(xiàn)為棕染；周圍細胞通過蘇木素染色細胞核呈藍染

PDGFR-α-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖6肝組織特洛細胞免疫組織化學PDGFR-α+單染(×400)

Fig6Single immunohistochemical staining for PDGFR-α-positive Telocytes in hepatic tissue (×400)

腎臟組織ApoE-/-小鼠腎臟組織分為3種結構即腎皮質、腎髓質和腎集合系統(tǒng)，選取CD34、CD117和PDGFR-α 3種免疫組織化學指標分別單染腎臟的以上3個結構，發(fā)現(xiàn)腎臟內特洛細胞對CD117和PDGFR-α陰性表達，腎小管上皮細胞卻對以上兩種免疫標記物出現(xiàn)陽性表達；在腎臟的3種不同結構中的特洛細胞對CD34陽性表達，特洛細胞在腎髓質內存在最為密集廣泛，形成的細胞間網(wǎng)狀結構最為明顯，其次是腎皮質和腎集合系統(tǒng)，且特洛細胞形成的三維結構皆圍繞腎小管分布，在腎小球周圍少見(圖7～11)。

腎臟組織中的特洛細胞對PDGFR-α陰性表達；藍色細胞核為經(jīng)蘇木素染色后表現(xiàn)

Telocytes in renal tissue are expressed PDGFR-α negative；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖7腎組織特洛細胞免疫組織化學PDGFR-α-單染(×132)

Fig7Single immunohistochemical staining for PDGFR-α-negative Telocytes in renal tissue (×132)

腎臟組織中的特洛細胞對CD34陽性表達呈棕色；周圍細胞核經(jīng)蘇木素染色后呈藍色；在腎小管周圍，特洛細胞之間形成三維網(wǎng)狀結構

CD34-positive Telocytes in kidney tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin；Telocytes form three-dimensional net structures around kidney tubules

圖8腎集合系統(tǒng)特洛細胞免疫組織化學CD24+單染(×400)

Fig8Single immunohistochemical staining for CD24-positive Telocytes in renal collecting system (×400)

討 論

特洛細胞是一種具有極長極薄端足的新型間質來源的細胞。自從Popescu 和Faussone-Pellegrini[1]率先將這種特殊的間質細胞用希臘文字命名為“Telcell”，為了更多的掌握此細胞的存在方式、形態(tài)結構和功能，國內外許多科研團隊越來越多地開始關注特洛細胞。目前已證實特洛細胞分別存在于人和實驗哺乳動物的各種空腔臟器性和非空腔臟器中。雖然近年來流式細胞術和免疫組織化學被引入到特洛細胞的研究中，但迄今為止，透視電鏡仍然是鑒別不同組織和器官中特洛細胞的“金標準”[1-2]。特洛細胞參與細胞間信號轉導或免疫調節(jié)，但更多未知的功能還需要探索。在2010至2018年，總共有332篇關于“特洛細胞”的科研報道，其中有2829條被引用在“科學網(wǎng)”上，關于特洛細胞的出版物和引文呈逐年上升的趨勢。1889年，西班牙神經(jīng)解剖學家圣地亞哥-拉莫和卡賈爾首次描述了一個紡錘形或三角形細胞，該細胞在腸道肌層和漿膜層中呈網(wǎng)狀結構。這些特殊細胞存在于神經(jīng)末梢和平滑肌細胞之間的間質中，將兩者細胞聯(lián)系在一起。在隨后的70～80年里，特洛細胞的存在、性質和功能在不同的科學家群體中引起了很大的爭議。到20世紀60年代，Taxi和 Eugène[25]首先描述Cajal間質細胞是一種新的細胞類型，它不同于神經(jīng)元、Schwann 細胞、平滑肌細胞、纖維細胞和具有超微結構的巨噬細胞。此后不久，Thuneberg[22]、Faussone Pellegrini等[23]分別證明了此間質細胞不是神經(jīng)元，而是胃腸運動和神經(jīng)傳導的起搏器。

存在于腎皮質和腎小管周圍的特洛細胞從形態(tài)和數(shù)量上皆區(qū)別于其他部位的特洛細胞，周圍細胞核經(jīng)蘇木素染色后呈藍色

The morphologies and amount of Telocytes differ between cortex renis and kidney tubules;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖9腎皮質區(qū)特洛細胞免疫組織化學CD24+單染(×400)

Fig9Single immunohistochemical staining for CD24-positive Telocytes in renal cortical section (×400)

特洛細胞聚集在腎髓質中，通過對CD34陽性表達，表現(xiàn)出不同形態(tài)的胞體，同時telopodes對CD34陽性表達;周圍細胞核經(jīng)過蘇木素染色后呈藍色

Telocytes are accumulated in medulla renis area,the CD34-positive Telocytes are manifested by different shapes,the telopodes are also positive for CD34;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖10腎髓質區(qū)特洛細胞免疫組織化學CD24+單染(×400)

Fig10Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in renal medulla renis area (×400)

腎臟內的特洛細胞對CD117陰性表達，周圍細胞核經(jīng)蘇木素染色后呈藍色

CD117-negative Telocyes in renal tissue;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

圖11腎組織特洛細胞免疫組織化學CD117-單染(×400)

Fig11Single immunohistochemical staining for CD117-negative Telocytes in renal tissue(×400)

特洛細胞有一個很小的胞體，有幾個非常長而薄的分支，電鏡下細胞體平均大小為(9.39±3.26)μm 。細胞胞體的形狀與端足的數(shù)目有關，如“梨型”細胞僅有1個端足，“紡錘體”型有2個端足，“三角形”有3個端足等[24]。其細胞內有卵圓形核，沒有明顯的核仁，異染色質團附著在核包膜上，占胞體的25%。核周細胞質含有多種線粒體、小高爾基體、少數(shù)粗糙光滑內質網(wǎng)和細胞骨架元素。線粒體豐富，占細胞總數(shù)的2%。小的高爾基體和光滑的內質網(wǎng)小于細胞體積的1%～2%，主要見于細胞的擴張。

本研究主要應用免疫組織化學的生物學指標對ApoE-/-小鼠心臟、肝臟和腎臟組織中的特洛細胞進行定性定位研究，發(fā)現(xiàn)特洛細胞在不同組織中存在的形式不同，與相應組織內其他細胞的關系也不同，且同時表現(xiàn)出不同的免疫組織化學指標。在心臟組織，特洛細胞對CD34、CD117和CD28皆為陽性表達且普遍存在于整個心肌內，表明心肌內的特洛細胞即有肌纖維細胞特異性生物標記物CD34的蛋白，推測特洛細胞在心肌內可能參與血管和心肌細胞生理、病理學的變化過程；在肝臟內，特洛細胞對CD34、CD117和PDGFR-α陽性表達，但特洛細胞胞體對PDGFR-α陰性表達，僅Telopodes對PDGFR-α陽性表達。特洛細胞存在于肝臟內的分布密度不同，圍繞在毛細肝管上皮細胞周圍的特洛細胞數(shù)量多，形成可見的網(wǎng)狀結構，在肝細胞、肝星形細胞等實質細胞周圍特洛細胞數(shù)量稀疏，細胞之間也不會出現(xiàn)網(wǎng)狀結構的形態(tài)改變；在腎臟中，特洛細胞免疫組織化學生物標記特性較為單一，對CD34陽性表達，但對CD117和PDGFR-α陰性表達，而且發(fā)現(xiàn)特洛細胞在不同腎臟結構中分布也存在明顯差異，由于腎臟內不同結構具有相應的不同的功能單位，對機體的內環(huán)境調節(jié)過程中起到的作用也不同，特洛細胞同時也因組織不同而表現(xiàn)差異，推測特洛細胞在調節(jié)不同功能細胞的過程中承擔不同的角色。

綜上，特洛細胞存在于ApoE-/-小鼠的心臟、肝臟和腎臟內，在特定的區(qū)域內形成明顯的網(wǎng)狀結構，且因不同的組織結構表達不同的生物免疫學指標。由于本研究重點在于應用不同的免疫組織化學方法對特洛細胞進行研究，因生物標記物的不全面而難以全面地推測特洛細胞可能存在的功能，在接下來的研究中，需要增加免疫熒光、蛋白組學和光學透視電鏡，甚至基因測序等不同實驗方法綜合性地對特洛細胞進行研究，明確其在特殊實驗動物體內真正的調節(jié)功能。