王 玲，林嫦娥，張 輝，謝仰杰，張春曉

( 1．集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2．農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

近年來隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，由養(yǎng)殖水體污染引發(fā)的病害問題成為影響?zhàn)B殖成功率的關(guān)鍵因素，因而養(yǎng)殖用水的水質(zhì)調(diào)控已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖者和科研工作者最關(guān)注的問題之一。導(dǎo)致水體污染的主要因素有殘餌、養(yǎng)殖生物的排泄物以及有機(jī)碎屑等[1]。換水可以減緩養(yǎng)殖水體污染，但是頻繁換水在增加養(yǎng)殖成本的同時(shí)也污染了周圍海區(qū)。生物修復(fù)技術(shù)成為當(dāng)今水產(chǎn)養(yǎng)殖水體處理研究的一大熱點(diǎn)。生物修復(fù)指通過生物和生態(tài)措施，修復(fù)受損水體的生態(tài)系統(tǒng)，改善生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)，增加養(yǎng)殖水體溶解氧含量，提高水質(zhì)和水體自凈能力[2]。生物修復(fù)法包括向水體中添加有益微生物[2-3]和定向培育有益微藻等措施[4]，目標(biāo)是分解水體中的污染物，提高水體的自凈能力。有研究表明利用藻類的吸收、富集和降解作用可以有效去除污水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、重金屬離子和有機(jī)毒物等[1，4-9]，而且小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)可以克服光自養(yǎng)培養(yǎng)的受光照限制及產(chǎn)量低等缺陷，快速有效地提高小球藻產(chǎn)量與產(chǎn)率[8，11-15]。Jinsoo等[16]用廢水培養(yǎng)小球藻時(shí)發(fā)現(xiàn)，小球藻對(duì)污水中的氮(氨和銨離子)有較高的利用率，由生物質(zhì)獲得的量幾乎等于從廢水中去除無機(jī)碳和氮的量。殷國(guó)梁[6]通過味精廢水對(duì)小球藻進(jìn)行自養(yǎng)、混養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，異養(yǎng)時(shí)小球藻對(duì)COD、Cr和氮的去除率分別能達(dá)到76.8%、77.9%和68.2%。另有研究[16-19]表明在高碳氮比時(shí)，異養(yǎng)藻的優(yōu)勢(shì)更明顯，從而水體中的氮、磷也消耗更多。因此，維持合適的碳氮比可以更好地發(fā)揮異養(yǎng)藻類對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化作用。本文擬以養(yǎng)殖水體中分離得到的異養(yǎng)微藻為研究對(duì)象，研究水體中不同濃度的葡萄糖對(duì)藻類異養(yǎng)生長(zhǎng)和對(duì)氮、磷利用的影響，以期為利用微藻進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控時(shí)把握碳源的添加量提供理論依據(jù)，為養(yǎng)殖池塘水質(zhì)調(diào)控探索新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用陳濤等[11]的無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。配方如下：NaNO30.75 g/L，KH2PO40.175 g/L，K2HPO40.075 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，CaCl2·2H2O 0.025 g/L，NaCl 0.025 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.287 mg/L，MnSO4·H2O 0.169 mg/L，H3BO30.061 mg/L，CuSO4·5H2O 0.0025 mg/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.001 24 g/L， pH=6.5。

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加25 mg/L的葡萄糖和100 IU/mL青霉素形成藻種分離培養(yǎng)基。

從福建漳浦某養(yǎng)殖池采集水樣，均勻涂布到平板分離培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待5～7 d后培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出異養(yǎng)藻類，再進(jìn)行分離培養(yǎng)，得到可異養(yǎng)的單株藻類。選取其中數(shù)量最多生長(zhǎng)最旺盛的一株，通過形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為小球藻(Chlorallasp.)。將已獲得的異養(yǎng)小球藻轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)后保種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻類馴化

由光培養(yǎng)保種的小球藻轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱，溫度為28 ℃，光照強(qiáng)度為3000～4000 lx，光暗周期為14 h∶10 h，培養(yǎng)5～7 d，至指數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 藻株無菌處理

將青霉素加入處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液中，至最終濃度為100 IU/mL。培養(yǎng)3 d后，取10 mL藻液加入到90 mL無菌培養(yǎng)液內(nèi)，再加入慶大霉素至其濃度為100 IU/mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，取10 mL加入90 mL無菌培養(yǎng)液內(nèi)，再加入卡那霉素至其最終濃度為100 IU/mL，再培養(yǎng)3 d。

1.2.3 藻種的暗培養(yǎng)

配制2倍營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基500 mL，加入無菌處理后指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液500 mL，用錫箔紙包裹整個(gè)錐形瓶，進(jìn)行暗培養(yǎng)馴化。每天鏡檢，觀察藻細(xì)胞的變化，15 d后，至藻種完全適應(yīng)暗培養(yǎng)再進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取異養(yǎng)小球藻液500 mL接入2000 mL的異養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L，每天搖瓶3至5次，暗培養(yǎng)7 d。

設(shè)計(jì)6個(gè)葡萄糖質(zhì)量濃度梯度：0、10、20、30、40和50 mg/L，分別記為C0、C1、C2、C3、C4和C5實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行。藻液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液按1∶5的比例混合后，分配到18個(gè)500 mL的錐形瓶中，每瓶300 mL，然后分別加入葡萄糖至設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度。測(cè)定培養(yǎng)前混合液的藻細(xì)胞、總氮和總磷的含量。用錫箔紙包裹錐形瓶，使瓶?jī)?nèi)光照度為0。放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度為28 ℃。每隔1 d 對(duì)藻細(xì)胞、總氮和總磷的含量進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)持續(xù)16 d。

1.2.5 測(cè)定方法

藻液含量的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，總磷的測(cè)定采用堿性過硫酸鉀氧化法，總氮的測(cè)定采用過硫酸鉀氧化法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)中各組同一培養(yǎng)時(shí)間的藻細(xì)胞、總氮和總磷的含量分別進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。如果差異顯著，則通過Tukey多重檢驗(yàn)來進(jìn)行比較，顯著性水平為P<0.05，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

利用氮含量和培養(yǎng)時(shí)間，建立折線回歸模型Y=L-U(R-XRL)。其中：R、L為折點(diǎn)的坐標(biāo)(R、L)，R為折點(diǎn)；XRL是小于R的自變量(X)值；U是指直線XRL的斜率，當(dāng)X>R時(shí)，定義(R-XRL)=0。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)異養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)的影響

異養(yǎng)小球藻的生長(zhǎng)情況如圖1所示，各組小球藻濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著增加(P<0.05),所有處理組從培養(yǎng)第5天開始藻細(xì)胞快速增長(zhǎng)。培養(yǎng)第5天后，C2、C3和C4組小球藻濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，第12天后，C3組小球藻濃度顯著高于其他各組(P<0.05)。

2.2 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)異養(yǎng)小球藻氮利用的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第3天時(shí)，C2和C3組培養(yǎng)液中氮的質(zhì)量濃度顯著低于其他各組 (P<0.05)。培養(yǎng)至第8～16天，C1～C5各組氮的質(zhì)量濃度均顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)； 而C1、C2、C3 、C4和C5各組之間的差異性不顯著(P>0.05)，但以C3組培養(yǎng)液中氮的質(zhì)量濃度最低。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組培養(yǎng)液中總氮的質(zhì)量濃度(Mean±SD)

說明：同一行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Note:Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)

選取對(duì)氮利用最快的C3組，對(duì)氮質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)氮的質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化顯著降低(P<0.05)，經(jīng)Tukey多重比較顯示，氮的質(zhì)量濃度在第1天、第3天、第5天和第8天差異顯著(P<0.05)，而第8天至第16天差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)回歸分析，繪制折線圖(如圖2)。由圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖添加的質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)，培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)液中氮的質(zhì)量濃度開始出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

2.3 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)異養(yǎng)小球藻磷利用的影響

由表2可見，實(shí)驗(yàn)開始第3天，C0對(duì)照組培養(yǎng)液中磷的濃度與C2組無顯著差異，但顯著高于C1、C3、C4和C5組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第5天，C3、C4和C5組的磷濃度無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于C0、C1和C2組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第8天時(shí)，各組間均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間各組培養(yǎng)液中磷的濃度(Mean±SD)

說明：同一行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Note:Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)

選取對(duì)磷利用最快的C3組，對(duì)磷濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)磷濃度隨時(shí)間變化顯著降低(P<0.05)，Tukey多重檢驗(yàn)顯示，磷濃度在第1天、第3天、第5天、第8天之間差異顯著(P<0.05)，第8～12天之間差異不顯著(P>0.05)，第12天與第14天差異不顯著(P>0.05)，第14與第16天差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

藻類的異養(yǎng)培養(yǎng)指藻細(xì)胞利用有機(jī)碳源在黑暗中生長(zhǎng)。Lewin等[7]于1953年首先發(fā)現(xiàn)了一些藻類能利用有機(jī)物作為唯一碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)。Endo等[8]篩選出了小球藻能夠利用的有機(jī)碳源包括糖、有機(jī)酸和醇類等60多種。Liu等[21]通過比較葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、醋酸和乙醇6種不同的碳源，發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)條件下培養(yǎng)小球藻最好的碳源是葡萄糖和果糖，其次是醋酸和乙醇，蔗糖和可溶性淀粉不適合作為碳源。本實(shí)驗(yàn)考慮葡萄糖比果糖成本更低，因此選用葡萄糖作為小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖能明顯影響小球藻的異養(yǎng)生長(zhǎng)，在一定葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)異養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)速度隨葡萄糖質(zhì)量濃度的升高而加快，葡萄糖質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)達(dá)最大值，葡糖糖質(zhì)量濃度再升高則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明葡萄糖質(zhì)量濃度不足會(huì)限制小球藻生長(zhǎng)，而高質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)小球藻的異養(yǎng)生長(zhǎng)也有抑制作用。Sasaki等[22]研究了小球藻與細(xì)菌混合培養(yǎng)的污水處理體系中葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度較低時(shí),藻細(xì)胞濃度也低，相對(duì)高的葡萄糖起始質(zhì)量濃度可用于培養(yǎng)高濃度的小球藻。諸多學(xué)者的研究也表明，小球藻異養(yǎng)過程中對(duì)葡萄糖的利用率很高，但高質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)有抑制作用[12-15,23]。

3.2 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)異養(yǎng)小球藻氮利用的影響

氮元素是微藻用于合成氨基酸、蛋白質(zhì)和酶等的必需元素，氮約占小球藻干重的10%，因此，小球藻的生長(zhǎng)必須要提供氮元素。Liu等[21]研究了不同氮源對(duì)異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)CO(NH2)2抑制異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)，而KNO3、NH4NO3、NH4Cl和(NH4)2SO4等4種氮源對(duì)異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)都有不同程度促進(jìn)作用。已有研究[9-10，24，25]表明，小球藻在異養(yǎng)條件下可以持續(xù)利用水體中的氮，從而起到凈化水體的作用。而養(yǎng)殖水體中的氮源主要有硝酸氮和銨態(tài)氮，據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中以NO3-和NH4+為主要的氮源。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)第3天時(shí)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中氮的質(zhì)量濃度顯著低于對(duì)照組，這表明葡萄糖的添加對(duì)異養(yǎng)小球藻的氮利用有促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)開始后的第3～8天，C2和C3組培養(yǎng)液中總氮的質(zhì)量濃度顯著低于其他組，說明添加20～30 mg/L葡萄糖能夠更好地促進(jìn)小球藻對(duì)水體中氮的利用。在本實(shí)驗(yàn)條件下，C3組小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的第3～7天，其對(duì)培養(yǎng)液中氮的利用率速率最快，第7天后趨于平緩。并且本實(shí)驗(yàn)中，異養(yǎng)小球藻的快速生長(zhǎng)出現(xiàn)在第3～14天，即異養(yǎng)小球藻快速生長(zhǎng)期持續(xù)到對(duì)氮最大利用的時(shí)間之后。馬宇翔等的研究[26]也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，他們發(fā)現(xiàn)在異養(yǎng)條件下，小球藻對(duì)氮、磷的利用在第2天達(dá)最大值，但第3天后藻體仍在快速生長(zhǎng)。說明在異養(yǎng)條件下小球藻可能可以利用蓄積的氮元素用于生長(zhǎng)。

3.3 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)異養(yǎng)小球藻磷利用的影響

藻類對(duì)水體中的氮、磷元素的利用常被應(yīng)用于凈化污水[9-10，16，19，24-26]。在本試驗(yàn)開始的前8天內(nèi)，各組培養(yǎng)液中總磷的濃度下降迅速，且在第5天時(shí)C3組培養(yǎng)液中磷的濃度顯著低于其他各組，說明短期內(nèi)，30 mg/L的葡萄糖質(zhì)量濃度能夠更好地促進(jìn)藻細(xì)胞吸收水體中的磷；實(shí)驗(yàn)開始8 d后，總磷的濃度下降緩慢，且各實(shí)驗(yàn)組水體中的磷含量差異不顯著。由圖3可知，葡萄糖添加量在30 mg/L時(shí)，異養(yǎng)小球藻對(duì)培養(yǎng)液中磷的快速利用發(fā)生在培養(yǎng)的前8天，而后磷濃度緩慢下降，這種現(xiàn)象與氮元素的變化相似，由此可以推測(cè)，在異養(yǎng)小球藻培養(yǎng)7～8天時(shí)需補(bǔ)充氮和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持小球藻的持續(xù)快速生長(zhǎng)。