陳穎

（商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院，陜西商洛 726000）

骨骼肌纖維類型最常用的劃分方法,是根據(jù)肌纖維具有不同的收縮特性將其劃分為快肌纖維和慢肌纖維[1]。有研究認(rèn)為，肌球蛋白重鏈異構(gòu)體決定著骨骼肌纖維類型，并將肌纖維劃分為：MHCI型和MHCⅡ型（包括Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅱx型）[2]。肌球蛋白重鏈（MHC）同功型成為區(qū)分肌纖維類型的分子標(biāo)志[3]。慢肌纖維主要表達(dá)MHCI型，快肌纖維主要表達(dá)MHCⅡ型?？旒±w維與慢肌纖維的主要區(qū)別在于它們的代謝方式，慢肌纖維以有氧氧化為主要代謝形式，而快肌纖維以糖酵解為主要代謝形式[4]。Azad等研究證明外界環(huán)境發(fā)生改變，慢肌纖維與快肌纖維之間可以相互轉(zhuǎn)換[5]。肌纖維中的MHC的表達(dá)會(huì)受外界刺激等因素的影響。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)肌纖維中的一些特定基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，以適應(yīng)其能量代謝方式的變化[6]。有研究證明耐力訓(xùn)練可以使肌纖維能量代謝方式由糖酵解型向氧化型轉(zhuǎn)換[7]。在人類通過耐力訓(xùn)練之后Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維同時(shí)存在于人類骨骼肌纖維中，專業(yè)運(yùn)動(dòng)員能經(jīng)過訓(xùn)練提高Ⅰ型肌纖維的含量[8]。對(duì)于肌纖維類型的轉(zhuǎn)化有人認(rèn)為是肌纖維上的特異性基因的表達(dá)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致信號(hào)通路的改變，引起肌纖維類型發(fā)生改變[9]。通過對(duì)所獲取的骨骼肌組織以及在不同糖濃度下培養(yǎng)的兩型肌纖維，進(jìn)行MHC同功型的檢測(cè)。觀察兩型肌纖維相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象及其特征。為研究肌纖維類型轉(zhuǎn)變提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

家兔、胰酶、PBS、Gibico胎牛血清、DMEM 高糖/低糖培養(yǎng)基、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、細(xì)胞總RNA提取試劑盒。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分組：取家兔固有半膜肌和副半膜肌背側(cè)亞部，將實(shí)驗(yàn)分為組織組、胰酶消化組、肌纖維高糖培養(yǎng)組以及肌纖維低糖培養(yǎng)組。所培養(yǎng)的兩型肌纖維在1、3、7 d取材，將所分的四組進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MHC的表達(dá)。

1.2.1 總 RNA 的提取

組織RNA提?。喝?0 g組織，加入200 μL的Trizol溶液進(jìn)行碾磨，碾磨成粉末狀后加入800 μL的Trizol溶液。將樣品在室溫中靜置5 min。隨后在4℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清。按每毫升Trizol液中加入0.2mL氯仿，混勻后靜置3 min。靜置后4℃下12 000 r·min-1離心15 min，離心后取上層水相至新的EP管，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置25 min，靜置后4℃下12 000 r·min-1離心10 min棄上清。加入與Trizol溶液等體積的75%乙醇DEPC，4℃，5 000 r·min-1離心3 min，倒出液體，重復(fù)上述步驟2次。在室溫下干燥3 min,將RNA溶于25 μL的RNase-Free ddH2O，-80℃下保存。

細(xì)胞RNA提?。簵壍艏?xì)胞培養(yǎng)基，用1mLTrizol溶液反復(fù)吹打細(xì)胞，將吹打下來的細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中，室溫靜置5 min。隨后的操作步驟同組織RNA提取。

1.2.2 cDNA 制備

取提取好的 RNA 3.1 mL，加入 5×gDNA Buffer溶液 2 μL，RNase-Free ddH2O 溶液 4.9 μL，將其混勻后短暫離心，在42℃下加熱3 min。隨后加入 10×Fast RT Buffer溶液 2 μL，RT 酶混合物1 μL，F(xiàn)Q-RT-Primer Mix 溶液 2 μL，無酶 DEPC水5 μL。將其混勻在42℃下加熱15 min，95℃下加熱3 min，將制得的模板DNA放于-20℃保存。

1.2.3 PCR 的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：DreamTaq Green PCR Master Mix溶液為 12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 DNA 1 uL，無酶 DEPC 水10.5 μL。將該溶液短暫離心混勻后，在PCR儀上90℃，15 min預(yù)變性，90℃，15 s；55℃ 30 s；72℃，30 s，共36個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織組MHC同功型mRNA檢測(cè)

由圖1中（a）和（b）可知，固有半膜肌亞部表達(dá)MHCⅠ，不表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。由圖2中（a）和（b）可知副半膜肌背側(cè)亞部只表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。進(jìn)一步證實(shí)副半膜肌為Ⅱ型肌纖維，固有半膜肌為Ⅰ型肌纖維。在組織離體過程中固有半膜肌和副半膜肌的能量代謝方式未發(fā)生改變。

圖1 兔固有半膜肌組MHC同功型mRNA檢測(cè)

2.2 兔固有半膜肌和副半膜肌背側(cè)亞部消化組MHC同功型檢測(cè)

由圖3中（a）和（b）可知，固有半膜肌亞部消化后只表達(dá)MHCⅠ，不表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。由圖4中（a）和（b）可知，副半膜肌背側(cè)亞部消化后只表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx不表達(dá)MHCⅠ。組織在離體后其組織的代謝方式并未發(fā)生變化，所以其纖維特性并未發(fā)生改變。

圖2 兔副半膜肌組MHC同功型mRNA檢測(cè)

圖3 兔固有半膜肌消化組MHC同功型mRNA檢測(cè)組

圖4 兔副半膜肌消化組MHC同功型mRNA檢測(cè)

2.3 Ⅰ型纖維和II型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型的檢測(cè)

由圖5 中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅰ型纖維高糖培養(yǎng)第1天時(shí)Ⅰ型纖維主要表達(dá)MHCⅠ型，少量表達(dá)Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx；第3天時(shí)MHCⅠ表達(dá)量降低，Ⅱa、Ⅱb及Ⅱx表達(dá)量增加；第7天MHCⅠ表達(dá)量進(jìn)一步降低，Ⅱa、Ⅱb及Ⅱx表達(dá)量進(jìn)一步增加。分析其原因主要為固有半膜肌亞部為Ⅰ型纖維，其能量代謝方式以有氧氧化為主，在高糖環(huán)境下，其代謝方式開始逐漸向糖酵解轉(zhuǎn)化，因此其肌纖維類型也開始向Ⅱ型纖維轉(zhuǎn)化，其中Ⅱa、Ⅱb以及Ⅱx表達(dá)量增加，MHCⅠ表達(dá)量逐漸減少。

圖5 Ⅰ型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測(cè)

由圖6中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅱ型纖維在高糖培養(yǎng)時(shí)，第 1、3、7 天均只表達(dá)Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx，不表達(dá)MHCⅠ。分析其原因可能為副半膜肌的能量代謝方式以糖酵解為主，在高糖環(huán)境中其能量代謝方式并未發(fā)生改變，所以Ⅱ型纖維的MHC的表達(dá)并未發(fā)生改變。

圖6 Ⅱ型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測(cè)

2.4 Ⅰ型纖維和II型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型的檢測(cè)

由圖7中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅰ型纖維在低糖培養(yǎng)第1天時(shí)不僅表達(dá)MHCⅠ，同時(shí)還少量表達(dá)Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx。第3天仍表達(dá)MHCⅠ但其表達(dá)量較第1天有所減少，Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx表達(dá)量有所增加。第7天時(shí)MHCⅠ表達(dá)量無明顯變化，Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx表達(dá)量較第3天無明顯變化，但仍比第1天有明顯增加。其原因主要為固有半膜肌亞部在體外培養(yǎng)過程中能量代謝方式發(fā)生變化由以前的有氧氧化變?yōu)樘墙徒猓瑢?dǎo)致其纖維類型開始表現(xiàn)出Ⅱ型肌纖維的特性。

圖7 Ⅰ型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測(cè)

由圖8中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅱ型肌纖維在低糖培養(yǎng)第1天時(shí)只表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。第3天仍表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx，但同時(shí)開始表達(dá)MHCⅠ。第7天同樣表達(dá)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx，進(jìn)一步表達(dá)MHCⅠ，其表達(dá)量進(jìn)一步增加。其原因?yàn)棰蛐图±w維在離體后其能量代謝方式未發(fā)生改變，所以仍維持其Ⅱ型肌纖維的特性，但由于糖含量的減少，為了能適應(yīng)低糖環(huán)境，同時(shí)也會(huì)表達(dá)出MHCⅠ型標(biāo)志蛋白，來提供充足的ATP。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)糖濃度出現(xiàn)改變時(shí)Ⅰ型纖維都會(huì)向Ⅱ型纖維轉(zhuǎn)換，骨骼肌纖維類型的轉(zhuǎn)變是為了適應(yīng)糖含量的不同而導(dǎo)致的能量代謝方式的轉(zhuǎn)變。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在Ⅰ型纖維中的含量最高，Ⅱ型纖維中含量相對(duì)較少。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)主要是與肌肉的代謝性質(zhì)有關(guān)，似乎與肌纖維類型沒有直接關(guān)聯(lián)。不同部位的肌肉即使是同一類型肌纖維，其葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的量可能也有很大的差別。

肌纖維類型的轉(zhuǎn)化不僅與糖濃度有關(guān)而且可能與培養(yǎng)基中的氧濃度有關(guān)，同時(shí)還認(rèn)為與信號(hào)通路有關(guān)，楊瑾等[10]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α就可以通過降低Mstn基因表達(dá)量來調(diào)節(jié)豬體內(nèi)肌纖維類型轉(zhuǎn)換。但其轉(zhuǎn)換過程中究竟涉及哪些通路、各通路的基因及蛋白表達(dá)水平的差異的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以激活CaN活性，引起NFATc1蛋白表達(dá)增加;誘導(dǎo)骨骼肌纖維由慢向快轉(zhuǎn)化。伴隨著運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌快型MHC向慢型MHC轉(zhuǎn)化過程中，CaN同樣發(fā)生了相應(yīng)的變化，CaN信號(hào)途徑與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化確實(shí)存在一定的關(guān)聯(lián)。慢肌纖維以有氧氧化為主要的能量代謝方式，肌質(zhì)中含有豐富的肌紅蛋白、線粒體、脂質(zhì)和毛細(xì)血管，具有相對(duì)低的肌球蛋白ATP酶活性和較少的糖原，而含有豐富的高活性有氧氧化關(guān)鍵酶。因此慢肌纖維收縮速度慢但較持久，并且有很好的耐疲勞性?？旒±w維其肌質(zhì)含有相對(duì)高的肌球蛋白ATP酶活性和較多的糖原，但脂質(zhì)和線粒體較少，有氧氧化關(guān)鍵酶活性低而磷酸化酶活性較高，其收縮特性為快速易疲勞不能持久，所以快肌纖維以糖酵解為其主要的供能方式。因此，慢肌纖維和快肌纖維在能量代謝方面存在明顯差異。通過研究骨骼肌纖維的相互轉(zhuǎn)換，能夠?yàn)檫\(yùn)動(dòng)員的選拔以及運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練項(xiàng)目的安排提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)還可以為與肌纖維有關(guān)的疾病例如肌萎縮等相關(guān)疾病的治療，提供理論基礎(chǔ)。

圖8 Ⅱ型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測(cè)