鄔光敏，郭媛媛，朱凡，張鎧，劉希宇，朱波

（1.云南省阜外心血管病醫(yī)院 血管外科，云南 昆明 650032；2.云南省昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，云南昆明 650032）

動(dòng)脈狹窄性疾病的治療理念處于不斷更新中，但自體靜脈移植，仍然是重建冠脈及外周動(dòng)脈的主要方式[1-2]。移植靜脈狹窄（vein graft stenosis，VGS）限制了其遠(yuǎn)期療效。但是，VGS的確切機(jī)制尚未闡明[3]。之前關(guān)于VGS的研究都基于一個(gè)假設(shè)：移植靜脈的內(nèi)膜增生，同動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生，具有相似的病理生理過程[4-6]。但是，基于上述思路的臨床實(shí)驗(yàn)并未改善移植靜脈的遠(yuǎn)期通暢率[7-8]。

發(fā)育生物學(xué)研究提示：胚胎期，循環(huán)系統(tǒng)建立之初，動(dòng)脈與靜脈就存在基因水平的差異[9]。ephrinB2及其受體EphB4這一對(duì)分子標(biāo)記物是血管形成過程中動(dòng)、靜脈分化的決定性分子，促使初期脈管分別向動(dòng)脈、靜脈分化。在成年動(dòng)物，兩者分別分布于動(dòng)脈、靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞，維持成年動(dòng)物動(dòng)、靜脈的結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)定，是動(dòng)、靜脈的分子指紋[10]。

前期研究[5,11]提示：移植靜脈適應(yīng)動(dòng)脈血流的過程具有其靜脈特異性，可能與動(dòng)脈損傷后的狹窄存在分子水平的差異。本研究采用成組設(shè)計(jì)，觀察不同EphB4表達(dá)量對(duì)移植靜脈吻合口管腔、內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力、ERK1/2（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑）通路活化的影響，探索EphB4相關(guān)、靜脈特異性的適應(yīng)動(dòng)脈血流的調(diào)控機(jī)制，從全新的視野為VGS的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性野生型SD大鼠50只，體質(zhì)量220～300 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心提供。成年雄性EphB4+/-型轉(zhuǎn)基因SD大鼠10只，體質(zhì)量220～300 g，由廣州賽業(yè)生物科技有限公司制備，昆明醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心繁育。大鼠均在“昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與操作規(guī)程”規(guī)范下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2 移植靜脈模型建立 2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，供體大鼠行胸部正中切口，剪取上腔靜脈約2 cm，置于肝素生理鹽水中備用。受體大鼠行腹部正中切口，暴露大鼠腹主動(dòng)脈及下腔靜脈并肝素化，血管夾阻斷主動(dòng)脈近遠(yuǎn)端血流，離斷腹主動(dòng)脈，將供體上腔靜脈以端端吻合方式，移植到受體腹主動(dòng)脈，重建動(dòng)脈血流[12]。

1.1.3 分組及處理 單純模型組：隨機(jī)選擇野生型大鼠20只（供體、受體各10只），建立移植靜脈動(dòng)物模型；EphB4增強(qiáng)組：將ephrinB2-Fc溶于PluronicF127膠與陽離子聚合物PEI的混合液中，配置為1 μg/mL；隨機(jī)選擇野生型大鼠20只（供體、受體各10只），建模后取混合物200 μL涂抹于移植靜脈外膜[4]；EphB4減弱組：隨機(jī)選野生型大鼠10只，EphB4+/-型大鼠10只，將EphB4+/-型轉(zhuǎn)基因大鼠靜脈行端端吻合，移植到野生型大鼠腹主動(dòng)脈。按取材時(shí)間不同，各組內(nèi)再分為術(shù)后1周組及術(shù)后4周組。

1.1.4 標(biāo)本的收集與處理 過量麻醉處死大鼠后，切取移植靜脈，置于4%多聚甲醛中過夜，石蠟包埋，制片備用。分別行：HE染色、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫組織化學(xué)染色、Masson染色，并測量移植靜脈內(nèi)膜+中膜厚度。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞來源 野生型大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞取自大鼠上腔靜脈，EphB4+/-型大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞取自EphB4+/-型大鼠上腔靜脈。

1.2.2 干預(yù)措施 以相同濃度的ephrinB2-Fc分別刺激野生型及EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR對(duì)比兩種細(xì)胞EphB4 mRNA的表達(dá)，進(jìn)行Western blot對(duì)比兩種細(xì)胞p-ERK1/2、磷酸化EphB4膜受體（p-EphB4R）表達(dá)的異同，進(jìn)行免疫熒光、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

大鼠ephrinB2-Fc蛋白購于Sino-biological公司，α-actin單克隆抗體、EphB4單克隆抗體，免疫組化染色試劑盒，免疫熒光染色試劑盒，PCR試劑盒等，均購于Cell signaling technology公司。

1.4 具體實(shí)驗(yàn)方法

HE染色，平滑肌細(xì)胞特異性染色（α-actin）及膠原纖維特異性染色Massion染色，由云南省阜外心血管病醫(yī)院病理科按相關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行。RT-PCR、Western blot、免疫熒光染色均按相關(guān)試劑盒操作規(guī)程完成。α-actin及Massion染色結(jié)果判定：在光強(qiáng)度及曝光度相同的條件下，每例切片在10×40光學(xué)顯微鏡下任選5個(gè)視野，測定其陽性顆粒的平均光密度值（optical density，OD），以此代表免疫組化陽性細(xì)胞的量。熒光染色結(jié)果判定：依照細(xì)胞陽性著色程度，可分為：弱陽性（+）1分；中等陽性（++）2分；強(qiáng)陽性（+++）3分。采用積分綜合計(jì)量。計(jì)算公式為：（+）%×1+（++）%×2+（+++）%×3；總數(shù)值＜0.5者為（-），＜1.0者為（+），1.0～1.5者為（++），＞1.5者為（+++）；至少隨機(jī)觀察5～10個(gè)視野。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，中央?yún)^(qū)域劃線，不同時(shí)間觀察周邊細(xì)胞是否移動(dòng)至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞遷移能力。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用NIH Image J醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色后的圖像進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果

建模成功后1、4周取材（共4組，n=5）。通過HE染色測量內(nèi)膜+中膜厚度（圖1），結(jié)果提示：與正常上腔靜脈比較，各實(shí)驗(yàn)組移植靜脈的內(nèi)膜+中膜厚度均明顯增加（均P＜0.05）；術(shù)后1周，各實(shí)驗(yàn)組組間內(nèi)膜+中膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后4周，各組內(nèi)膜+中膜厚度組間比較出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。其中，ephrinB2增強(qiáng)組內(nèi)膜+中膜厚度明顯低于模型組，而EphB4減弱組內(nèi)膜+中膜厚度明顯高于ephrinB2增強(qiáng)組（均P＜0.05），但EphB4減弱組與模型組間差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。α-actin及Massion染色結(jié)果顯示：術(shù)后4周，ephrinB2干預(yù)組α-actin陽性細(xì)胞及膠原纖維表達(dá)，明顯低于對(duì)照組，而EphB減弱組則高于ephrinB2增強(qiáng)組（圖1）（表1）（均P＜0.05）。

圖1 大鼠正常上腔靜脈與術(shù)后4周各組移植靜脈標(biāo)本染色結(jié)果（×100）Figure 1 Staining results of the normal rat superior vena cava and the vein graft s od each experimental group at 4 weeks aft er model creation（×100）

表1 大鼠正常上腔靜脈與各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜+中膜厚度、α-actin及膠原纖維含量比較（ ±s）Table 1 Comparison of the intima-media thickness,and the contents of smooth muscle actin and collagen fiber among normal rat superior vena cava and the experimental groups（ ±s）

表1 大鼠正常上腔靜脈與各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜+中膜厚度、α-actin及膠原纖維含量比較（ ±s）Table 1 Comparison of the intima-media thickness,and the contents of smooth muscle actin and collagen fiber among normal rat superior vena cava and the experimental groups（ ±s）

注：1）與正常上腔靜脈比較，P＜0.05；2）與同組術(shù)后1周比較，P＜0.05；3）與EphB4增強(qiáng)組比較，P＜0.05Note:1）P＜0.05 vs. normal rat superior vena cava; 2）P＜0.05 vs. same group at 1 week aft er model creation; 3）P＜0.05 vs. EphB4 enhancing group

2.2 磷酸化水平檢測結(jié)果

相同濃度ephrinB2-Fc（1 μg/mL）分別刺激野生型（EphB4+/+）及EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光與Western blot結(jié)果均顯示，EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2、EphB4R磷酸化程度弱于野生型（圖2）；qRT-PCR結(jié)果顯示，EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的EphB4 mRNA轉(zhuǎn)錄活性明顯低于野生型（P＜0.05）（圖3）。

2.3 細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種內(nèi)皮細(xì)胞在同等條件、相同濃度ephrinB2-Fc（1 μg/mL，6 h）刺激下，EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移程度明顯低于野生型（P＜0.05）（圖4）。

圖2 野生型與EphB4+/-型大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2、EphB4R磷酸化程度比較Figure 2 Comparison of the degrees of phosphorylation of EphBR and ERK1/2 between vein endothelial cells from wild type and EphB4+/- type rats

圖3 野生型與EphB4+/-型大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄活性比較Figure 3 Figure 2 Comparison of the transcriptional activityies of EphB4 mRNA between vein endothelial cells from wild type and EphB4+/- type rats

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Results of scratch-wound assay

3 討 論

無論是靜脈移植重建動(dòng)脈[13]，還是血管介入治療腔內(nèi)重建動(dòng)脈[14-15]，其共同的瓶頸就是術(shù)后再狹窄。這一問題一直是心血管病內(nèi)、外科醫(yī)生面臨的重要挑戰(zhàn)，此過程所特有的復(fù)雜機(jī)制尚無任何學(xué)說能夠做出清楚的解釋。

動(dòng)脈術(shù)后再狹窄的共同通路是：血管內(nèi)膜高度增生[16-17]。由于動(dòng)、靜脈的內(nèi)膜增生有著相似的病理生理過程和臨床結(jié)局，過去的研究都是基于同一個(gè)假設(shè)，也就是動(dòng)、靜脈的內(nèi)膜增生擁有共同機(jī)制。處理動(dòng)脈內(nèi)膜增生的治療策略，同樣被應(yīng)用于處理移植靜脈的內(nèi)膜增生?？梢愿爬椋豪貌煌d體，將不同的治療因子轉(zhuǎn)染致靜脈移植物管壁，或直接利用藥物涂層支架[18]或者涂層球囊[19]，改善靜脈移植物或介入治療后動(dòng)脈的遠(yuǎn)期通暢率，但是運(yùn)用于臨床，未能達(dá)到預(yù)期的治療效果。

基于發(fā)育生物學(xué)及課題組前期研究結(jié)果[20-21]，本研究的假設(shè)是：成年動(dòng)物，靜脈具有可塑性，靜脈分子指紋EphB4的表達(dá)量，可能是移植靜脈內(nèi)膜增生的核心調(diào)節(jié)因子。保證EphB4的表達(dá)，可維持靜脈結(jié)構(gòu)及功能的“穩(wěn)態(tài)”，可能將減少移植物的內(nèi)膜增生及管腔狹窄。研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面驗(yàn)證了假設(shè)。靜脈移植術(shù)后4周，EphB4增強(qiáng)組的內(nèi)膜+中膜厚度，平滑肌細(xì)胞增殖程度均較EphB4減弱組及模型組顯著減少。從組織學(xué)層面提示EphB4表達(dá)量的差異對(duì)內(nèi)膜增生的影響。細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證EphB4表達(dá)量不同時(shí)，EphB4膜受體磷酸化，下游傳導(dǎo)通路ERK1/2的激活程度不同。劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)M了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，EphB4+/-型靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移程度顯著低于野生型，推測基因敲除后的內(nèi)皮細(xì)胞功能弱化。雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能完全反映動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中內(nèi)膜增生及管壁重塑的機(jī)制，但可以推測：內(nèi)皮細(xì)胞功能的減弱，可能是導(dǎo)致移植靜脈管壁增厚的原因之一。ERK1/2信號(hào)通路與EphB4信號(hào)通路有密切關(guān)聯(lián)[22-23]，且同時(shí)滿足以下條件：(1)同EphB4一樣在靜脈源細(xì)胞中表達(dá)；(2)在VGA過程中，其蛋白表達(dá)的改變與移植靜脈內(nèi)膜增生過程密切相關(guān)[24]；(3)ERK1/2與Eph家族有交互作用[25]。通過ERK通路阻斷實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了ERK1/2在EphB4主導(dǎo)的調(diào)控過程中所起的作用。

通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了靜脈特異性內(nèi)膜增生的機(jī)制之后，下一步的工作將集中對(duì)動(dòng)脈特異性的內(nèi)膜增生進(jìn)行研究，從一個(gè)新的角度來探索動(dòng)、靜脈內(nèi)膜增生的分子本質(zhì)差異。移植靜脈適應(yīng)動(dòng)脈血流的過程中，保證靜脈指紋分子EphB4的表達(dá)，可能保持了移植靜脈的靜脈屬性，減輕血管重塑，改善移植靜脈狹窄；EphB4-ERK1/2在靜脈特異性的調(diào)控機(jī)制中的可能通過控制EphB4的表達(dá)而起主要作用。