俞媚華, 熊 娟, 達慎思

(復旦大學 藥學院, 上海 201203)

防己是防己科千金藤屬植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore的干燥根,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中對其就有記載“防己如險健之人,幸災樂禍,能首為亂階,若善用之,亦可御敵。其名或取此義。解離,因其紋解也”[1]。民間傳統(tǒng)將其用于治療風濕關(guān)節(jié)疼痛,濕熱肢體疼痛，現(xiàn)代醫(yī)學研究又發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗過敏、降血壓和保護心肌等作用[2]。防己中含有大量的生物堿,其中大部分是雙芐基異喹啉生物堿,漢防己甲素和乙素含量較高,活性也最佳[3]。

“漢防己生物堿的提制和鑒定”一直是復旦大學藥學院“實驗藥物化學I”一個較為經(jīng)典的實驗[4],要求學生掌握總生物堿中酚性叔胺堿和非酚性叔胺堿分離與純化的方法,了解生物堿類化學成分的沉淀反應(yīng),是一個專業(yè)性較強的基礎(chǔ)實驗。但該實驗存在一些問題：屬驗證性實驗,學生只需按部就班地完成實驗,記錄實驗現(xiàn)象,專業(yè)綜合知識得不到體現(xiàn)；實驗前學生僅從課本中了解防己藥材中含生物堿類成分,沒有實驗的感性認識；防己藥材利用萃取、重結(jié)晶的方法進行提取和粗分離,只能得到漢防己甲素和乙素的混合物,不能完全分開；沒有化合物的純化和純度測定步驟,學生對化合物純度沒有概念；幾乎沒有使用任何精密的大型儀器。顯然這樣的實驗已經(jīng)不能滿足現(xiàn)行天然藥物化學實驗教學要求,因此將這個實驗設(shè)計為綜合性實驗,使學生將所學的天然藥物化學、藥物分析學、現(xiàn)代色譜技術(shù)、波譜解析等多門課程的知識在實驗中綜合應(yīng)用,提高了學生實驗技能。

1 防己中不同活性成分綜合性實驗設(shè)計簡介

1.1 實驗目的

(1) 掌握脂溶性酚性生物堿與非酚性生物堿的提取分離方法；

(2) 了解正交試驗優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的提取工藝；

(3) 學習柱色譜分離漢防己甲素和乙素；

(4) 熟悉生物堿的一般理化性質(zhì)及各種檢識方法。

1.2 實驗原理和主要內(nèi)容

本實驗利用正交實驗優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的最佳提取工藝,強化天然藥物化學中提取這一關(guān)鍵步驟；防己中叔胺型生物堿的親脂性,采用有機溶劑萃取分離脂溶性生物堿和親水性生物堿；利用漢防己甲素和乙素結(jié)構(gòu)上的差別——7位取代基的差異,采用柱色譜分離二者[5-6]；利用高效液相色譜儀(HPLC)評價防己正交實驗結(jié)果以及最后分離得到的單體化合物,采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振儀(NMR)、紅外(IR)、紫外(UV)等波譜手段解析結(jié)構(gòu)。

2 防己中不同活性成分綜合性實驗方案

2.1 正交實驗優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的提取工藝

2. 1.1 正交實驗設(shè)計

取藥材量100 g,選用L9(34)正交表,以浸膏得率、漢防己甲素含量、漢防己乙素含量為綜合考查指標,進行了9次實驗,分別考查提取次數(shù)、提取時間、溶劑用量和乙醇濃度。其中各因素水平具體見表1[7]。

表1 正交實驗因素與水平表

2.1.2 綜合評價指標的選擇

防己生物堿是防己的主要活性成分,其中漢防己甲素和乙素占了總藥材的1%左右；故選用這2個成分的含量與浸膏得率(權(quán)重比5∶5) 進行綜合評分,以綜合評分結(jié)果進行提取工藝最佳參數(shù)的優(yōu)選。綜合評分計算分值方法如下：綜合評分=(漢防己甲素、乙素含量總和) / Max(漢防己甲素、乙素含量總和)×0.5+浸膏得率×0.5/Max(浸膏得率)。

2.1.3 檢測方法

(1) 漢防己甲素和乙素測定方法。色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(70∶30)；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL[8]。

(2) 對照品溶液制備和線性關(guān)系考查。精密稱取漢防己甲素對照品、漢防己乙素對照品適量,加甲醇制成每1 mL含漢防己甲素50 μg、漢防己乙素25 μg 的混合溶液[9]。取對照品混合溶液5、10、15、20、25、30 μL,分別注入色譜儀,以峰面積的積分值為縱坐標,以對照品溶液的進樣量(μg) 為橫坐標,繪制標準曲線。由于實驗時間有限，此兩部分會在預實驗時完成。學生實驗以講解HPLC的操作使用為重點。

(3) 供試品溶液制備。精密量取防己提取液50 mL,水浴旋蒸至近干,加1%鹽酸15 mL,濾去不溶物,加濃氨水4 mL,加氯仿50 mL萃取3次,合并提取液,蒸干氯仿層,殘渣加甲醇溶解,并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻即得。

2.1.4 實驗結(jié)果

用SPSS19.0 軟件[10]對漢防己甲素和漢防己乙素和浸膏得率的綜合評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析,正交實驗結(jié)果、極差、方差分析結(jié)果見表2、表3、表4。

表2 正交實驗結(jié)果表

表3 極差分析

表4 醇提工藝方差分析

根據(jù)極差分析和方差分析結(jié)果可見,各因素的影響大小順序為: B > D > C > A,最佳提取工藝條件為B3D3C3A1,其中因素B 即提取次數(shù)有極顯著性影響; 其他各因素均未有顯著性影響,考慮到60%的乙醇實驗室減壓濃縮耗時較長,故選擇D1C3A1。即防己的提取工藝條件為：以6 倍量95%乙醇提取3 次,每次1 h。

本實驗結(jié)果為預實驗結(jié)果,根據(jù)每年實驗藥材批次不同可能會有所不同。每組學生自由選取1個實驗方案進行實驗,結(jié)合各組的實驗結(jié)果學習如何使用正交實驗的方法優(yōu)化提取工藝。但由于每組學生操作習慣不同,極差和方差可能會偏大。

2.2 防己中活性成分的分離

2.2.1 萃取法提取非酚性親脂性叔胺生物堿

選取正交實驗方案得到的防己乙醇提取液,減壓濃縮近干,加入1% HCl,充分攪拌,直至加酸水時溶液不發(fā)生渾濁為止,過濾棄去沉淀。濾液滴加濃氨水中和至pH 9左右,此時親脂性的叔胺堿游離析出,用氯仿500 mL分3次萃取水層,合并得氯仿溶液。以1%氫氧化鈉溶液200 mL分3次萃取,再以水20 mL/次洗滌2次。得氯仿層,減壓濃縮得粗制非酚性親脂性叔胺生物堿[11]。

2.2.2 重結(jié)晶純化叔胺生物堿

將非酚性生物堿用加丙酮熱溶解,重結(jié)晶,待結(jié)晶析出后,將母液與晶體分離。母液再濃縮重復處理,尚可得結(jié)晶。合并多次結(jié)晶,為漢防己甲素和乙素的混合物[12]。

2.2.3 柱色譜分離漢防己甲素和乙素

(1) 裝柱：稱取20 g硅膠(200～300目)加入50 mL二氯甲烷拌成勻漿,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入層析柱內(nèi),等待柱子壓實；

(2) 上樣：取漢防己甲素和乙素的混合物100 mg加入二氯甲烷1 mL溶解后,用滴管將溶液沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。

(3) 洗脫: 二氯甲烷∶甲醇=20∶1為洗脫劑,進行洗脫,收集流份3 mL左右/份

(4) 薄層色譜檢識：以二氯甲烷∶甲醇=10∶1為展開劑,以對照品作對照,相同斑點的組分合并,稱重。

2.3 HPLC(面積歸一化法)測定純度

使用正交實驗的色譜條件,測定漢防己甲素和乙素的純度,結(jié)果表明漢防己甲素純度為98.93%、漢防己乙素純度為98.85%。

2.4 漢防己甲素和乙素的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色針狀結(jié)晶(丙酮中結(jié)出),熔點150～152 ℃/217～218 ℃。UV(MeOH) 譜圖中在230、280 nm處有吸收峰,說明化合物1中有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。IR譜圖中在1 605、1 462 cm-1處的吸收峰也證明化合物1中有苯環(huán)存在。EI-MS圖譜中給出[M + H]+.峰為623,高分辨質(zhì)譜給出分子式：[C38H43N2O6]+.,計算不飽和度為18,說明化合物1有可能是雙芐基異喹啉生物堿。結(jié)合化合物1的1H-NMR(400 MHz, CDCl3)數(shù)據(jù)δ ppm: 3.72(1H, d,J= 9.6 Hz, H-1), 2.36(3H, s, NCH3), 2.91(1H, m, Ha-3), 3.48(1H, m, Hb-3), 2.39(1H, m, Ha-4), 2.89(1H, m, Hb-4), 6.29(1H, s, H-5), 3.75(3H, s, 6-OCH3), 3.18(3H, s, 7-OCH3), 2.48(1H, dd,J= 14.4, 1.8 Hz, Ha-α), 2.67(1H, dd,J= 14.4, 10.2 Hz, Hb-α), 6.52(1H, d,J= 2.2 Hz, H-10), 3.91(3H, s, 1-OCH3), 6.81(1H, d,J= 8.4 Hz, H-13), 6.86(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14), 3.84(1H, d,J= 11.4, 6.0 Hz, H-1′), 2.64(3H, s, N′-CH3), 2.83(1H, m, Ha-3′), 3.39(1H, m, Hb-3′), 2.69(1H, m, Ha-4′), 2.91(1H, m, Hb-4′), 6.52(1H, s, H-5′), 3.38(3H, s, 6′-OCH3), 6.00(1H, s, H-8′), 2.77(1H, dd,J= 11.4, 12.6 Hz, Ha-α), 3.22(1H, dd,J= 12.6, 6.0 Hz, Hb-α′), 6.27(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-10′), 6.77(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-11′), 7.13(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-13′), 7.34(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14′)。與文獻對照[13],證明化合物1為漢防己甲素。

化合物2為白色粒狀結(jié)晶(丙酮中結(jié)出),熔點177～179 ℃/237～238 ℃。UV和IR譜圖與化合物1相似。EI-MS圖譜中給出[M + H]+.峰為609,高分辨質(zhì)譜給出分子式：[C37H41N2O6]+.,計算不飽和度為18,說明化合物2也可能是雙芐基異喹啉生物堿。結(jié)合1H- NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm: 2.37(3H, s, 2-NCH3), 2.39～2.45(1H, m), 2.53～2.57(1H, m), 2.68(3H, s, 2′-NCH3), 2.70～3.03(7H, m), 3.23～3.31(1H, m), 3.39(3H, s, 6′-OCH3), 3.41～3.65(2H, m), 3.74～3.78(1H, m, H-1), 3.78(3H, s, 6-OCH3), 3.88～3.94(1H, m, H-1′), 3.93(3H, s, 12-OCH3), 6.05(1H, s, H-8′), 6.31(1H, s, H-5), 6.34(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-10′), 6.55(1H, s, H-5′), 6.57(1H, s, H-10), 6.82(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-11′), 6.86(2H, br s, H-13, H-14), 7.13(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-13′), 7.36(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-14′)。與文獻對照[14],證明化合物2為漢防己乙素。

3 結(jié)語

通過上述實驗設(shè)計,將“漢防己生物堿的提制和鑒定”設(shè)計成為綜合性實驗,增加了正交法優(yōu)化提取工藝的步驟,使原本簡單枯燥的提取步驟也變得有意義起來。在正交實驗里,學生不僅可以學習如何從植物中提取有效成分,更可以學會如何使工藝最優(yōu)化；用多種提取分離方法提取分離純化生物堿類化合物,通過酸提堿沉、有機溶劑萃取、重結(jié)晶和柱色譜法聯(lián)合使用,使學生熟悉天然藥物化學中最常用的幾種分離純化化合物的操作方法；增加純度測定和結(jié)構(gòu)解析的方法,使學生掌握HPLC、紅外和紫外分光光度計的簡單使用。通過質(zhì)譜、核磁共振等波譜技術(shù)分析單體化合物結(jié)構(gòu),使學生對結(jié)構(gòu)解析的過程有一定的感性認識。

綜上所述,以防己作為一個典型案例,使學生對植物藥的研究有一個較為全面的了解, 其中包括天然藥物化學、藥物化學、藥物分析等多學科內(nèi)容。這樣的實驗教學模式的設(shè)計[15]不僅可以培養(yǎng)學生動手實踐能力、綜合知識運用能力,更能使學生盡早地接觸科研,參與科研,大大縮短學習的適應(yīng)期,培養(yǎng)出“知識、能力、素質(zhì)”綜合發(fā)展的創(chuàng)新型人才。