李佛生, 胡舒昶, 謝 鑫, 李一璠, 汪 杭, 馮 蘭, 楊 鑫

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 四川 成都 610065)

紅原地區(qū)的牦牛是四川省阿壩藏族羌族自治州紅原地區(qū)的標(biāo)志性物種,其對高原地區(qū)高寒 、低氧等惡劣自然條件具有良好的適應(yīng)能力,其養(yǎng)殖完全依賴紅原天然草場,其乳、肉營養(yǎng)價值極高,在高原地區(qū)具有不可替代的生態(tài)與經(jīng)濟地位[1]。腹瀉問題是牦牛犢不能正常發(fā)育甚至死亡的重要原因。牦牛腹瀉的感染性因素主要有細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲感染和缺乏微量元素。目前對于常見畜牧產(chǎn)品腹瀉問題的研究基本都涉及細(xì)菌感染因素,如郭建超[2]、夏晨陽[3]等探討了豬、羊腹瀉的細(xì)菌感染因素,但有關(guān)牦牛腹瀉疾病的研究多見病毒感染因素,少見對細(xì)菌感染因素研究。本實驗有助于補充牦牛腹瀉在細(xì)菌感染方面的研究。

本檢測從紅原地區(qū)腹瀉犢牛采集腹瀉糞樣,分離、鑒定細(xì)菌,采用藥敏紙片法進行藥敏試驗,得到細(xì)菌耐藥譜,從而為紅原地區(qū)牦牛腹瀉問題的抗生素解決方案提供了建議和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本次試驗所用菌株均由小組成員于2017年在四川省阿壩藏族羌族自治州中部紅原縣紅原地區(qū)16頭牦牛犢腹瀉糞樣中分離得到,本次腹瀉樣本共計16份,其中1份為血樣糞便。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.2.1 微生物培養(yǎng)基

PBS磷酸緩沖鹽溶液、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、三糖鐵培養(yǎng)基(CN)、麥康凱培養(yǎng)基(MC)，瓊脂購自國產(chǎn)生物試劑公司。

1.2.2 實驗試劑

PrimerSTAR Max DNA Polymerase、DNA Maker和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自大連寶生物公司，引物合成自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 藥敏紙片

9種抗生素藥敏紙片(紅霉素(E)、慶大霉素(CN)、四環(huán)素(TE)、萬古霉素(VA)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、氯霉素(C)、氨曲南(ATM)、氟苯尼考(FFC))購自英國Thermofisher SCIENTIFIC生物科技公司。

1.2.4 儀器設(shè)備

PCR儀(Bio-rad T100)、生化培養(yǎng)箱LRH-250A型、離心機(eppendorf 5424)、生物安全柜BHC-1300A2型、全自動立式高壓滅菌器(ZEALWAY GR85DA)、冰箱BCD-301型、搖床。

1.3 菌株的分離、純化與鑒定

1.3.1 菌株的分離純化

采樣后將糞樣暫時置于冰盒中保存,并立即帶回實驗室,按照糞樣與PBS磷酸緩沖鹽溶液比例為1∶4處理糞樣,混勻后放入離心機以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min,并取上清液備用；配置BHI液體培養(yǎng)基,在10 mL的EP管中加入5 mL BHI液體培養(yǎng)基和1 mL糞樣上清液,放入搖床中在37 ℃下?lián)u晃過夜；之后采用平板劃線法將細(xì)菌分別接種至伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、三糖鐵培養(yǎng)基(CN)、麥康凱(MC)培養(yǎng)基上,在37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)；取出過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿,挑取培養(yǎng)基上的單菌落，并接種至裝有5 mL BHI培養(yǎng)基的10 mL EP管中,在37 ℃的搖床中振蕩過夜；取出EP管得分離純化的菌株。

1.3.2 菌落的形態(tài)學(xué)鑒定

通過長出菌落的形態(tài),包括大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等進行粗略鑒定[4]。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

將分離純化好的菌株37 ℃培養(yǎng)過夜后,分別挑取菌落,采用16S rRNA細(xì)菌鑒定的通用引物1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′,27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,進行PCR擴增,得到目的片段約為1500 bp。PCR 擴增體系(25 μL)： PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL,引物F/R各1.0 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,35 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序[5-7]。

1.4 藥敏試驗

1.4.1 菌株復(fù)蘇

從-20 ℃冰箱中取出冷凍保存的菌株,在常溫下靜置;配置LB液體培養(yǎng)基,加入到10 mL 滅菌后的EP管中,每支EP管中加入5～6 mL配置好的LB液體培養(yǎng)基;再加入復(fù)蘇后的菌液20 μL；將EP管捆綁好放入搖床中,在37 ℃下以180 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩過夜。

1.4.2 耐藥性檢測

采用藥敏紙片法測定64株菌株對9種抗生素的耐藥情況[8-11]。在培養(yǎng)皿內(nèi)放置完藥敏紙片后將培養(yǎng)皿倒置,放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后,通過測量抑菌圈直徑對菌株的耐藥性進行記錄和比較,并根據(jù)CLSI M100-S20標(biāo)準(zhǔn)[12],得到不同菌株對不同抗生素的耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣品細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

用EMB培養(yǎng)基篩選19株菌株,用MSA培養(yǎng)基篩選出16株菌株,用CN培養(yǎng)基篩選出9株菌株,用麥康凱培養(yǎng)基篩選出20株菌株。對所得菌株進行16S rRNA基因序列分析,最終篩選鑒別出64株菌株,其中包含沙門氏菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、成團泛菌和阪崎腸桿菌(見表1)。

表1 紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣品細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

表1(續(xù))

注：編號中的數(shù)字代表糞樣編號；編號中的第1個和第2個英文字母代表篩選出菌種所用的培養(yǎng)基英文縮寫,EMB培養(yǎng)基縮寫為E,MSA培養(yǎng)基縮寫為MS、CN培養(yǎng)基記為CN、麥康凱培養(yǎng)基記為MC；編號中的第3個字母表示挑取菌落的顏色,R表示紅色,W表示白色,B表示黑色,Y表示黃色。

2.2 耐藥結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌耐藥率

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果(見圖1和圖 2)統(tǒng)計,得細(xì)菌耐藥率見表2—表5。表中耐藥率和敏感率數(shù)值后括號內(nèi)/后的數(shù)字為樣品數(shù)，/前的數(shù)字為耐藥樣品或敏感樣品數(shù)。

圖1 大腸桿菌(9EB)的藥敏試驗結(jié)果

圖2 沙門氏菌(9MS)的藥敏試驗結(jié)果

具體情況如下：大腸桿菌對各藥物耐藥率R有：R(VA)(93.33%)>R(E)(86.67%)>R(C)(53.33%)>R(TE)(20.00%)>R(SXT/FFC)(13.33 %)，但對CN、CIP、ATM耐藥率為0,對CN、CIP、ATM的敏感率為100%。

沙門氏菌對各藥物的耐藥率有：R(E/VA)(100.00%)>R(C)(91.89%)>R(FFC)(8.11%)>R(SXT)(2.70%)，但對CN、TE、ATM耐藥率為0，對各種藥物的敏感率S有：S(CN/CIP/ATM)(100.00%)>S(SXT)(94.59%)>S(TE)(62.16%)>S(FFC)(40.54%)>S(C)(5.41%)。

坂崎腸桿菌對各藥物耐藥率有：R(E)(100.00%) >R(VA)(75.00%)>R(TE/C)(50.00%)>R(CIP/SXT)(25.00 %)，但對CN、ATM、FFC的耐藥率為0,對CN、ATM的敏感率為100.00%。

糞腸球菌對E/VA/C藥物的耐藥性為100.00%；CN/CIP/SXT/ATM敏感率為100.00 %，對FFC為50.00%。成團泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對E/VA均耐藥,并且成團泛菌、芽孢桿菌對C也耐藥；成團泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對CN、CIP、SXT、ATM都敏感,此外,成團泛菌和枯草芽孢桿菌還對FFC敏感,芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌還對TE敏感。

表2 大腸桿菌菌株對抗生素的耐藥情況

表3 坂崎腸桿菌菌株對抗生素的耐藥情況

表4 糞腸球菌菌株對抗生素的耐藥情況

表5 沙門氏菌菌株對抗生素的耐藥情況

2.2.2 多重耐藥譜

由圖3可知,紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣細(xì)菌對E、VA和C耐藥,對FFC和TE的耐藥性差異很大,但對CN、CIP、ATM和SXT敏感。然而,值得注意的是,紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣中大腸桿菌和沙門氏菌均產(chǎn)生1種以上抗生素的多重耐藥性,且大多數(shù)存在3種以上抗生素的多重耐藥情況,分別占53.33 %和91.89 %(見表6)。

圖3 菌株對不同抗生素的柱形耐藥譜

抗生素種數(shù)大腸桿菌耐藥菌株數(shù)占菌株數(shù)百分比/%沙門氏菌耐藥菌株數(shù)占菌株數(shù)百分比/%0種00001種213.33002種533.3338.113種及以上853.333491.89

3 討論

本次測檢從紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣中分離了得到了7種共64株菌株,其中主要包括了大腸桿菌(23.44 %)和沙門氏菌(57.81 %)。而周雪雁等人從健康牦牛糞樣中分離得到糞腸球菌[13],劉明春等人從犢牛腹瀉糞樣中分離得到大腸桿菌[14]。相較于之前的研究,本實驗從罹患腹瀉牦牛的腹瀉糞樣中分離得到更加全面的致病菌種,具有較大的參考價值。

本次檢測使用了藥敏紙片法，檢測了64株紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣細(xì)菌菌株對9種抗生素的耐藥性,完善了紅原地區(qū)牦牛腹瀉致病菌的耐藥譜。通過耐藥率和多重耐藥情況可以看出,試驗菌種的耐藥譜范圍有限,普遍對特殊的幾種抗生素(E和VA)產(chǎn)生極強的耐藥性,卻對其他數(shù)種抗生素(CN、CIP、SXT、ATM)表現(xiàn)出高度敏感。相比之下,喻華英等人的研究缺少了四環(huán)素、萬古霉素、氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗,但增加了頭孢唑啉、阿莫西林、諾氟沙星、痢特靈的藥敏試驗[15-16]；劉明春等人的研究缺少了氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗,但增加了妥布霉素、丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢哌酮、利福平、氟哌酸、呋喃妥因、卡那霉素、氨芐西林的藥敏試驗[13],可與本次試驗互為補充。與喻華英等人的藥敏試驗結(jié)果相比,本試驗中大腸桿菌對CIP、CN極為敏感,對E高度耐藥,與其試驗結(jié)果基本一致,但敏感和耐藥程度都相對更高；沙門氏菌對CIP、CN、SXT都極為敏感,敏感程度相對更高,而對E具有極強的耐藥性,這與喻華英等人的試驗結(jié)果不相一致。

本試驗結(jié)果中,大多數(shù)菌種對不同抗生素的耐藥性幾乎呈現(xiàn)出較為極端的情況(耐藥或敏感程度接近100 %),并且不同菌種的耐藥情況有很大重疊。這可能與紅原當(dāng)?shù)亻L期使用少數(shù)幾種抗生素防治牦牛腹瀉疾病,從而導(dǎo)致致病菌對這幾種抗生素(E、VA、C)產(chǎn)生了較為單一并且極強的耐藥性,而對其他抗生素高度敏感有關(guān)。此外,紅原地區(qū)地處高原、較為封閉的特殊地理環(huán)境,也可能是紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣中細(xì)菌具有如此獨特的耐藥情況的重要原因。

根據(jù)本次試驗結(jié)果可以推測,對于紅原地區(qū)牦牛腹瀉疾病,使用多樣化的抗生素,能夠有效控制紅原地區(qū)牦牛的腹瀉病情。雖然對于引起紅原地區(qū)牦牛腹瀉的致病菌,僅僅依靠試驗所使用的抗生素中的一種或兩種,就能有效抑制致病菌的增殖,但是由于抗生素的單一使用,極易使致病菌產(chǎn)生在短時間內(nèi)產(chǎn)生新的耐藥性,并不適用于長期控制紅原地區(qū)牦牛的腹瀉疾病。就抗生素防治而言,嘗試尋找新的抗生素,減少同種抗生素的重復(fù)使用,同時利用現(xiàn)有抗生素和新抗生素進行防治,是較為合理解決方案。除此之外,嘗試運用生態(tài)學(xué)方法防治紅原地區(qū)牦牛腹瀉的發(fā)生可能是更加有利于生態(tài)保護、更加持久的解決方案。