（廈門醫(yī)學(xué)院，福建廈門361021）

鮑魚是一種海洋貝類，只有半面外殼，屬單殼軟體動(dòng)物，體型扁而寬，以攝食海藻和浮游生物為生[1]。鮑魚的天然產(chǎn)量很少，但隨著技術(shù)的發(fā)展，鮑魚人工繁殖已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。近年來，隨著我國(guó)水產(chǎn)行業(yè)的不斷發(fā)展，鮑魚養(yǎng)殖技術(shù)的應(yīng)用和完善，我國(guó)的鮑魚產(chǎn)量也在不斷增加，而在鮑魚的加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，如鮑魚內(nèi)臟、鮑魚殼等，對(duì)于這些下腳料的處理以及高效應(yīng)用問題也引起人們的關(guān)注。鮑魚內(nèi)臟占鮑魚總質(zhì)量的30%左右，其中含有大量的蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等[2]，如何合理運(yùn)用這些廉價(jià)而又豐富的天然海洋資源是十分值得研究的。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，CE3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，別名纖維二糖酶、龍膽二糖酶和苦杏仁苷酶。它屬于纖維素酶類，是一種能催化水解芳基和烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶對(duì)于纖維素的降解作用顯著，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)有十分重要的作用[3]。

雙水相萃取技術(shù)（aqueous two phase extraction，ATPE）作為近幾年發(fā)展較為迅猛的新型液-液萃取技術(shù)，與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比具有高含水量（70%～90%）、分相時(shí)間短、條件溫和、易于工藝放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，在快速的將大量雜志去除的同時(shí)還能較好的保護(hù)生物活性物質(zhì)，使其不易變性失活[4-5]。目前雙水相萃取技術(shù)已應(yīng)用于蛋白質(zhì)、生物酶、菌體、細(xì)胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子物質(zhì)的分離、純化[6]。

目前已有研究運(yùn)用常規(guī)的冷提取方法分離純化出鮑魚內(nèi)臟中的β-葡萄糖苷酶[7-8]，本研究則是在最佳冷提取條件下，加入超聲波破碎輔助常規(guī)方法提取鮑魚內(nèi)臟中β-葡萄糖苷酶，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)法找到最合適、最高效的超聲輔助條件，在此基礎(chǔ)上，加入雙水相萃取技術(shù)，探究萃取效果最佳的雙水相系統(tǒng)組成，以求達(dá)到更高的提取率和回收率，為相關(guān)酶的提取純化、酶學(xué)性質(zhì)的研究提供便利，同時(shí)也為鮑魚內(nèi)臟的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

皺紋盤鮑內(nèi)臟：廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院提供，-20℃下冷凍儲(chǔ)藏待用；對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：北京索萊寶科技有限公司；對(duì)硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)（A25乳化機(jī)）：：上海歐河；Scientz-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；3-18K高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)sigma；AF100制冰機(jī)：意大利斯科茨曼；Epoch 2酶標(biāo)儀：BioTek Instrum ents，Inc.。

1.3 超聲波輔助提取的試驗(yàn)方法

1.3.1 鮑魚內(nèi)臟的預(yù)處理

取一定質(zhì)量的鮑魚內(nèi)臟，以1∶4的質(zhì)量比加入預(yù)冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH=4.5），在冰浴中用組織搗碎機(jī)勻漿后待用[5]。

1.3.2 超聲輔助粗酶液的提取

將上述預(yù)處理液等量分裝至小燒杯中，放入超聲波破碎機(jī)中，采用冰浴冷卻法，一次超聲時(shí)間5 s～10 s，間隔時(shí)間5s～10 s，處理一定時(shí)間后取出，放置于冰浴中浸提一段時(shí)間，用高速冷凍離心機(jī)離心（10 000 r/min，4℃，15 min），取上清液。

1.3.3 酶活力的測(cè)定

酶活定義：一定條件下，1 mL酶液在1 min內(nèi)水解p-NPG 產(chǎn)生 1 μmol對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol）定義為一個(gè)酶活力單位（U）。采用p-NPG比色法，在403 nm處的吸光值來測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活力大小[9]。計(jì)算公式如下：

式中：U為β-葡萄糖苷酶酶活性，U/mL；K為曲線斜率；A為403 nm處的平均吸光度；為對(duì)硝基苯酚的量，μmol；4 為反應(yīng)體系的總體積，mL；10 為反應(yīng)時(shí)間，min；0.1為加入的酶量，mL；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 超聲輔助鮑魚內(nèi)臟粗酶液提取工藝的單因素試驗(yàn)

以β-葡萄糖苷酶酶活力為指標(biāo)，探究超聲波輔助處理鮑魚內(nèi)臟對(duì)β-葡萄糖苷酶提取的影響，分別考察以下4個(gè)因素：超聲的預(yù)處理液體積、超聲波功率、超聲時(shí)間、超聲后浸提時(shí)間。

1.3.5 超聲輔助鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶提取工藝的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響試驗(yàn)的3個(gè)主要因素：超聲波功率、超聲總時(shí)間、超聲后浸提時(shí)間作為考察因素，在各因素選取3個(gè)最佳的水平條件，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，做三因素三水平正交試驗(yàn)，以確定β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取的最佳工藝條件。正交表設(shè)計(jì)見表1。

1.4 雙水相技術(shù)萃取粗酶液中β-葡萄糖苷酶

1.4.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖的制作

在室溫下，將 6 種分子量的 PEG（600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000）分別配置成一定質(zhì)量比的溶液待用。準(zhǔn)確稱取一定量某一分子量的PEG溶液，加入試管中置于天平上，然后逐滴加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的（NH4）2SO4溶液，充分混合，直至出現(xiàn)渾濁為止，靜置或離心后能分離成相，記錄加入的（NH4）2SO4溶液的質(zhì)量，從而計(jì)算出PEG、（NH4）2SO4和水在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 超聲輔助提取β-葡萄糖苷酶正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test of the ultrasonic assisted β-glucosidase extraction factors and their levels

1.4.2 β-葡萄糖苷酶雙水相萃取

體系總質(zhì)量固定為10 g，按上述成相條件，準(zhǔn)確稱取一定量的PEG溶液和（NH4）2SO4溶液于干燥的試管中，加入1 mL粗酶液，混勻后3 000 r/min低溫離心3 min，記錄上下兩相的體積比，分別測(cè)定上下兩相的酶活。

1.4.3 雙水相萃取法中各參數(shù)的計(jì)算[10]

相比R=下相體積/上相體積；分配系數(shù)K=下相酶活/上相酶活；萃取率Y/%=（R×K）/（1+R×K）×100

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 p-Nitrophenol standard curve

如圖 1，回歸方程為 y=16.115x+0.0243，R2=0.999 9，斜率K=16.115。

2.2 鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取工藝的單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲的預(yù)處理液體積對(duì)酶活的影響

在超聲功率為240 W，超聲時(shí)間為15 min，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測(cè)定不同體積的預(yù)處理液進(jìn)行超聲波處理對(duì)其酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲的預(yù)處理液體積對(duì)酶活的影響Fig.2 The effect of ultrasonic pretreatment liquid volume on enzyme activity

由圖2可知，根據(jù)預(yù)處理液體積的遞增，酶活力呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)預(yù)處理液量過少時(shí)，超聲發(fā)熱過快導(dǎo)致酶活大量損失；而當(dāng)預(yù)處理液量過大時(shí)，破碎率下降，導(dǎo)致目標(biāo)酶濃度降低，總酶活降低。因此，選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)處理液體積進(jìn)行試驗(yàn)才能較客觀明顯的反映出不同的超聲因素和條件下酶活的變化，因此選擇10 mL的預(yù)處理液進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)試驗(yàn)較為合適。

2.2.2 不同超聲波功率對(duì)酶活的影響

在預(yù)處理液體積為10 mL，超聲時(shí)間為20 min，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測(cè)定不同超聲功率對(duì)粗酶液酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲波功率對(duì)酶活的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on enzyme activity

由圖3可知，當(dāng)超聲功率小于180 W時(shí)，隨著功率的增加，細(xì)胞破碎效果越好，目標(biāo)酶的酶活力呈逐漸增大的趨勢(shì)；當(dāng)超聲功率大于180 W后，酶活力則隨著功率的增大呈逐漸下降的趨勢(shì)。該結(jié)果產(chǎn)生可能是由于10 mL體積的預(yù)處理液在超聲功率在180 W附近時(shí)，細(xì)胞破碎率較高，且能保持較好的酶活性，而隨著功率的不斷增加，破碎率增大的同時(shí)，破碎時(shí)產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致更多的酶變性失活，且變性速度大于破碎釋放目標(biāo)酶的速度。所以處理10 mL預(yù)處理液時(shí)，超聲功率在180 W時(shí)是較適宜條件。

2.2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)酶活的影響

在預(yù)處理液體積為10 mL，超聲功率為180 W，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測(cè)定不同超聲時(shí)間對(duì)粗酶液酶活力的影響結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on enzyme activity

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間少于20 min時(shí)，酶活隨著超聲時(shí)間的增加而增大；當(dāng)超過20 min后，酶活隨著時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)。該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是超聲時(shí)間過短時(shí)（少于20 min）細(xì)胞破碎率較低，目標(biāo)酶釋放量隨著時(shí)間增加而增加；當(dāng)超聲時(shí)間超過20 min后，超聲引起的發(fā)熱導(dǎo)致目標(biāo)酶開始大量變性失活導(dǎo)致酶活不斷喪失。所以選擇超聲處理時(shí)間為20 min為較最適宜條件。

2.2.4 超聲后的浸提時(shí)間對(duì)酶活的影響

在預(yù)處理液為10 mL，超聲功率為180 W，超聲處理時(shí)間為20 min的條件處理后，考察浸提時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)粗酶液酶活的影響結(jié)果見圖5。

圖5 超聲后浸提時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.5 The effect of extraction time on enzyme activity

由圖5可以看出，隨著浸提時(shí)間的增加，目標(biāo)酶活呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在浸提時(shí)間為3 h時(shí)，酶活力相對(duì)較高。因此超聲處理后浸提時(shí)間為3 h為較適宜條件。

2.3 鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取工藝的正交試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。方差分析見表3。

表2 超聲輔助提取β-葡萄糖苷酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result on the orthogonal test of the ultrasonic assisted β-glucosidase extraction

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

根據(jù)極差R值可見，RA＞RB＞RC，所以超聲波輔助提取鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶的影響因素主次順序?yàn)椋撼曨l率＞超聲時(shí)間＞超聲后浸提時(shí)間。即超聲頻率影響最大，其次是超聲的時(shí)間，超聲后浸提時(shí)間則影響較小。

試驗(yàn)指標(biāo)的影響規(guī)律和趨勢(shì)，由圖6所示。

由表2的極差分析結(jié)果可以看出，在超聲輔助鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶的提取過程中，影響目標(biāo)酶酶活的因素按影響大小排序依次為A＞B＞C，即超聲功率＞超聲時(shí)間＞超聲后浸提時(shí)間。由表3的方差分析可以看出，其中，超聲功率對(duì)目標(biāo)酶的提取具有顯著性影響，超聲時(shí)間對(duì)其影響并不顯著，而超聲后浸提時(shí)間可視為誤差所致，可不作為影響因素。

由表2及圖6可以得出最佳的條件水平組合為A2B3C3，即當(dāng)超聲功率為180 W，超聲時(shí)間為20 min，超聲后浸提時(shí)間為3 h時(shí)為最佳工藝條件；但根據(jù)上述極差結(jié)果以及提取過程中各類成本的綜合考慮，可將浸提時(shí)間縮短至1 h作為最佳條件。

圖6 因素與指標(biāo)趨勢(shì)圖Fig.6 Factors and index trend chart

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由上述結(jié)果可知，正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，但根據(jù)方差分析及綜合成本考慮，縮短浸提時(shí)間至1 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即超聲功率為180 W，超聲時(shí)間為20 min，超聲后浸提時(shí)間為h；與最佳工藝組合（超聲功率為180 W，超聲時(shí)間為20 min，超聲后浸提時(shí)間為3 h）進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The optimal extraction process validation test results

表4結(jié)果可見，超聲后浸提1 h的平均酶活基本與浸提3 h的平均酶活沒有顯著區(qū)別，但超聲后浸提1 h能大大縮短時(shí)間和材料成本，故可作為最佳條件。

2.5 雙水相體系中各因素對(duì)粗酶液中β-葡萄糖苷酶的萃取效果的影響

2.5.1 雙水相體系相圖

圖7是不同分子量的PEG與（NH4）2SO4的雙水相相圖，曲線上的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，曲線下方不分相，上方為兩相區(qū)。PEG在上相富集，下相則為（NH4）2SO4。

圖7 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖Fig.7PEG/（NH4）2SO4aqueous two-phase system phase diagram

從圖7中可以看出，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量一定時(shí)，PEG分子量越大越容易形成雙水相體系；當(dāng)PEG分子量一定時(shí)，（NH4）2SO4過低時(shí)難以成相，過高時(shí)則易飽和難以溶解，所以在選擇PEG分子量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)和（NH4）2SO4需考慮三者的相互關(guān)系[11]。

2.5.2 PEG分子量對(duì)萃取的影響

根據(jù)相圖，固定（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，選擇不同分子量的 PEG（600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000），并將其質(zhì)量分?jǐn)?shù)也固定為16%，組成雙水相體系，考察相關(guān)各項(xiàng)參數(shù)的變化情況，結(jié)果如表5所示。

表5 PEG分子量對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 5 The effect of the molecular weight of PEG on βglucosidase extraction

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶的分配系數(shù)足夠大，第一次萃取就能大量富集分配至下相（NH4）2SO4相，而雜蛋白和細(xì)胞碎片都停留在上相PEG相，有較好的分配效果。由表5可知，當(dāng)PEG分子量較小或較大時(shí)，分配系數(shù)K和萃取率Y均較??；當(dāng)PEG分子量為1 000時(shí)，分配系數(shù)K和萃取率Y均最大。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是隨著PEG分子量增加，疏水性增大，成相時(shí)分配的水分就越少，上相體積減小，下相體積增大；此雙水相體系中，當(dāng)PEG分子量較小時(shí)，β-葡萄糖苷酶能較多的富集在下相，即（NH4）2SO4鹽相，且能保持較高酶活力，但隨著PEG分子量增大，β-葡萄糖苷酶會(huì)逐漸向上相富集，但由于上相雜蛋白、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)過多，加上PEG疏水性增大，最終可能導(dǎo)致酶活大量損失，且難以與其他雜質(zhì)分離，所以分配系數(shù)和回收率逐漸減??；但當(dāng)PEG分子量過小時(shí)（600），該體系萃取效果不佳，雜質(zhì)與目標(biāo)酶并未有明顯分離，所以PEG分子量為1 000時(shí)，分配系數(shù)最大，下相對(duì)目標(biāo)酶的萃取率最高。

2.5.3 PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取的影響

固定（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取的影響，結(jié)果如表6所示。

表6 PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 6 The effect of the mass fraction of PEG1000 on βglucosidase extraction

根據(jù)表6結(jié)果表明，體系中PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)萃取效果最好。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%時(shí)體系不成相，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，兩相體積比逐漸減小，分配系數(shù)和萃取率也隨之下降。所以選擇PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%萃取效果最佳。

2.5.4 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取的影響

根據(jù)上述結(jié)果，固定PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的（NH4）2SO4對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響。結(jié)果如表7所示。

表7 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 7 The effect of the mass fraction of（NH4）2SO4on βglucosidase extraction

根據(jù)表7的結(jié)果可以看出，當(dāng)（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于16%時(shí)，體系不成相；隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，下相體積增大，分配系數(shù)逐漸減小，萃取率也呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這是因?yàn)榱蛩徜@屬于強(qiáng)電解質(zhì)，濃度過高時(shí)會(huì)中和蛋白質(zhì)表面電荷，破壞表面的水化膜，不利于目標(biāo)酶的提取。所以選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的（NH4）2SO4最為合適。

2.5.5 雙水相體系的pH值對(duì)萃取的影響

根據(jù)上述結(jié)果，確定雙水相體系組成為PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，考察體系的pH值對(duì)萃取效果的影響，由于（NH4）2SO4在堿性條件下易水解，從而破壞雙水相的穩(wěn)定性，所以pH值選擇的考察范圍為3～7之間。結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取的影響Fig.7 The effect of pH on β-glucosidase extraction

該雙水相體系的pH值由（NH4）2SO4決定，其顯弱酸性，使該體系形成的自然pH值為5。由圖7可以看出，隨著pH值逐漸增大，其分配系數(shù)和萃取率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為5時(shí)，β-葡萄糖苷酶的分配系數(shù)和萃取率最佳。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可以確定出一套較為優(yōu)化的超聲輔助提取鮑魚內(nèi)臟中β-葡萄糖苷酶的工藝條件，同時(shí)可以得出各因素對(duì)酶活的影響大?。撼暪β蕦?duì)酶活有顯著性影響，超聲時(shí)間則影響較小，超聲后浸提時(shí)間基本不作為影響條件。通過最終的驗(yàn)證試驗(yàn)確定超聲輔助鮑魚內(nèi)臟中β-葡萄糖苷酶提取的最佳工藝條件為：10 mL的鮑魚內(nèi)臟預(yù)處理液，在超聲波功率為180 W，超聲時(shí)間為20 min，超聲后浸提時(shí)間為1 h。該工藝條件下，能從鮑魚內(nèi)臟中獲得比常規(guī)冷提取方法獲得的活力更大的β-葡萄糖苷酶，且綜合成本較低。

通過考察鮑魚內(nèi)臟粗酶液中的β-葡萄糖苷酶在PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中的分配規(guī)律，可以得出對(duì)目標(biāo)酶具有最佳萃取效果的雙水相體系為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%PEG1000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 16%的（NH4）2SO4，體系pH值為5（自然）。與傳統(tǒng)方法相比，雙水相萃取不但有較高的提取率，還能進(jìn)一步去除大量的雜質(zhì)，達(dá)到分離純化的效果，同時(shí)還能保持目標(biāo)酶較高的活性，是一種高效環(huán)保又節(jié)約的分離提取方法。后續(xù)試驗(yàn)還將對(duì)該方法的鹽種類及其他條件進(jìn)行探究，并通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)組合。該研究能為海洋生物下腳料中有效生物活性物質(zhì)的分離提取提供一種新的方法和思路，對(duì)未來的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。