苗林平 ， 霍 麗 ， 徐 力 ， 周瑞佳 ， 楊明琰 ,2*， 樊 成

（1. 長(zhǎng)安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054；2. 旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710054；3. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督研究院，陜西 西安 710048）

面對(duì)日益枯竭的能源問題，發(fā)展生物質(zhì)能源是解決該問題的重要途徑。木質(zhì)纖維素資源是地球上現(xiàn)存量最大的生物質(zhì)資源，可作為生物乙醇生產(chǎn)的重要來源[1-2]。農(nóng)作物秸稈是木質(zhì)纖維素原料的重要來源。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源年產(chǎn)量近7.284×104萬t，而每年焚燒處理量超出50%，這不僅導(dǎo)致環(huán)境污染，還造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[3-4]。因此，利用工業(yè)技術(shù)和生物質(zhì)生產(chǎn)將木質(zhì)纖維原料中的糖類和芳香族化合物轉(zhuǎn)化為化工產(chǎn)品，對(duì)發(fā)展新能源、保護(hù)環(huán)境意義重大[5]。

木質(zhì)纖維原料主要組份是纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，其生物轉(zhuǎn)化工藝包括預(yù)處理、酶解和發(fā)酵[6]。而預(yù)處理又最為關(guān)鍵，其目的是分離或除去包裹在纖維素表面的木質(zhì)素、半纖維素，破壞纖維內(nèi)部的氫鍵和葡萄糖單元之間的β-1,4-糖苷鍵，改變晶體形態(tài)，降低聚合度，增大原料的比表面積和孔隙率[7]，從而提高酶解效率?，F(xiàn)如今常用的處理方法分物理法、化學(xué)法、生物法、物化耦合法[8]。其中化學(xué)法中的堿處理因?yàn)樘幚項(xiàng)l件溫和，不易產(chǎn)生酶解抑制物等優(yōu)點(diǎn)而研究較多，并且在堿性條件下加入O3、過氧化氫類氧化劑除了能強(qiáng)化脫除木質(zhì)素，改善產(chǎn)品色澤，還可以作為半纖維素的溫和增溶劑，促進(jìn)半纖維素的溶出[9]。

本文在溫和條件下用堿性過氧化氫處理小麥秸稈，分別研究了過氧化氫濃度、處理溫度、處理時(shí)間對(duì)原料化學(xué)成分及酶解效率的影響，確定其最佳預(yù)處理?xiàng)l件；對(duì)預(yù)處理后的樣品進(jìn)行了SEM和 FT-IR表征，分析預(yù)處理對(duì)原料形貌及官能團(tuán)變化的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

小麥秸稈采自陜西省長(zhǎng)安縣，經(jīng)過清洗，除去混雜的雜草泥沙，自然風(fēng)干，粉碎，過 10目篩，放入塑封袋中置于干燥器中備用。

氫氧化鈉，過氧化氫，冰乙酸，間苯三酚，濃硫酸，濃鹽酸，均為分析純。

Cellic? CTec2（abbreviated CTec2），由Novozymes諾維信中國(guó)公司提供，酶活性147 FPU/mL。

1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)-752N，上海儀電分析儀器有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；SEM-掃描電鏡，Hitachi S-3700，蘇州佐藤精密儀器有限公司；FT-IR傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀，廈門市安奈特科貿(mào)有限公司。

1.3 預(yù)處理方法

稱取5.0 g絕干備好的小麥秸稈物料，按固液比為1∶10加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%氫氧化鈉（實(shí)際混合后濃度為1.0%）和預(yù)設(shè)條件于恒溫，轉(zhuǎn)速120 r/min的搖床中處理一定時(shí)間。對(duì)處理樣品進(jìn)行抽濾，將濾渣用去離子水洗滌至中性，自然抽干控制含干量約10%～20%，計(jì)算絕干質(zhì)量和失重率。取樣檢測(cè)濾渣中三素含量。

1.3.1過氧化氫濃度對(duì)原料化學(xué)成分的影響

恒溫25℃，氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的堿性環(huán)境，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）7個(gè)水平條件下按“1.3”進(jìn)行預(yù)處理24 h，再將預(yù)處理的樣品按“1.4”進(jìn)行酶解72 h。

1.3.2預(yù)處理溫度對(duì)小麥秸稈化學(xué)成分的影響

分別設(shè)定處理溫度為 20、30、40、50、60℃氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的堿性環(huán)境，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為2.0%，按“1.3”進(jìn)行預(yù)處理2 h，再將預(yù)處理的樣品按“1.4”進(jìn)行酶解72 h。

1.3.3預(yù)處理時(shí)間對(duì)小麥秸稈化學(xué)成分的影響

恒定處理溫度為30℃，氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% 的堿性環(huán)境，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為2.0%，分別設(shè)定處理時(shí)間為0、4、8、12、24、48 h，按“1.3”進(jìn)行預(yù)處理，再將預(yù)處理的樣品按“1.4”進(jìn)行酶解72 h。

1.4 酶解方法

分別稱取未處理和處理后1 g絕干樣品于100 mL具塞三角瓶中，加入pH5.5，50 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使固含量為2.0%，并按0.5 g/L 加入抗生素，再加入纖維素酶15 FPU/g葡萄糖，混合搖勻后置于溫度為50℃，恒溫振蕩器中的轉(zhuǎn)速為180 r/min進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。定時(shí)取樣（4、8、12、24、48、72 h），以13 000 r/min速度離心，取其上清液用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖含量，并計(jì)算酶水解效率（SED，substrate enzymatic digestibility）。其公式如式（1）所示。

式中：SED為酶水解效率，%；Cglu是酶解液中葡萄糖的濃度，g/L；V是酶解液的體積，L；W是樣品的絕干重量，g；Mglu是樣品中纖維素含量，%。

1.5 三素分析方法

麥稈中三素含量測(cè)定方法采用NERL兩步酸水解法[10]。稱取干燥恒重0.300 0 g的絕干物料加入10 mL試管中，做平行樣三組，再加入3.00 mL濃度為72%硫酸，攪拌均勻使其充分混合后置于30℃的恒溫水浴中保溫60 min，每5～10 min取出試管搖勻；取出試管分批次慢慢加入84 mL去離子水轉(zhuǎn)移至100 mL三角瓶中，使酸濃度稀釋到4%，塞緊塞子，搖勻，在滅菌鍋中121℃，1 h，取出自然冷卻瓶體。酸水解物料后使用G3砂芯漏斗真空過濾后，濾液用來測(cè)定其中葡萄糖和木糖含量，其中葡萄糖含量采用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定，木糖含量采用分光光度法，濾渣用來測(cè)定木素含量。

1.6 預(yù)處理材料表征分析

1.6.1掃描電鏡分析

分別取少量原料及預(yù)處理樣品，經(jīng)冷凍干燥后，用導(dǎo)電雙面膠將其固定在掃描電鏡的樣品臺(tái)上，并進(jìn)行噴金處理。分別在500及2 000倍下觀察并拍攝具有代表性的形貌。

1.6.2傅里葉變換紅外光譜分析

KBr 磨成粉末狀后壓片測(cè)得其基底，再分別取微量樣品放入研缽中，與KBr一起研磨，使樣品與KBr充分混合，然后取少量粉末放在磨具上壓成薄片，使用MA GNA2IR750型傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜掃描后去除基底得到紅外光譜圖，分析產(chǎn)物的官能團(tuán)的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 過氧化氫濃度對(duì)麥稈化學(xué)成分及酶解糖化率的影響

小麥秸稈中含有纖維素 34.10%±1.54%、半纖維素 24.98%±1.82%、木質(zhì)素 23.04%±2.45%、其它17.88%±1.98 %（含灰分7.11%±2.33 %）。在2% NaOH堿性條件下，采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)H2O2預(yù)處理24 h，麥稈化學(xué)成分的變化及酶解結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在堿性條件下，隨著過氧化氫濃度的增加，樣品纖維素含量有一定增加，半纖維素及木質(zhì)素含量均有顯著下降。隨著H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至2%，半纖維素脫除率達(dá)到40.09%，木質(zhì)素脫除率達(dá)到47.63%，之后其脫除率減緩。在堿性過氧化氫處理?xiàng)l件下，氫氧根離子能夠削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵及皂化（堿與酯生成醇和羧酸鹽）半纖維素和木質(zhì)素之間的酯鍵，促進(jìn)半纖維素和木質(zhì)素的溶出[7-9]。同時(shí)過氧化氫在堿性條件下電離成的過氧氫根離子，具有強(qiáng)氧化作用，會(huì)與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈和苯環(huán)氧化后的發(fā)色基團(tuán)反應(yīng)。通過和對(duì)側(cè)鏈發(fā)生烷基化親核反應(yīng)，在側(cè)鏈上形成不穩(wěn)定的共振雜化體，使木質(zhì)素的共扼側(cè)鏈發(fā)生氧化斷裂，增強(qiáng)了反應(yīng)產(chǎn)物的親水性。并且反應(yīng)過程也會(huì)改變它的骨架。木質(zhì)素的一些發(fā)色基團(tuán)如亞甲基型、醌型還有比如共扼羰基和羰基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成親水性的羧基和羥基，促進(jìn)木質(zhì)素溶解，從而降低處理后的小麥秸稈中木質(zhì)素含量[11-12]。由酶解率SED的變化可知，隨著過氧化氫濃度增加，SED顯著提高，在過氧化氫濃度為2.0%時(shí)，SED由對(duì)照組的70.32% 提高至92.96%，此后酶解率趨于平緩。綜合濾渣三素含量及酶解率的變化，過氧化氫濃度過高，雖然能脫除更多的半纖維素及木質(zhì)素，但也會(huì)造成一定的纖維素的損失。因此，確定過氧化氫濃度為2.0%為合適的濃度。

圖1 過氧化氫濃度對(duì)麥稈化學(xué)成分 及酶解效率SED的影響

圖2 過氧化氫作用時(shí)間對(duì)麥稈化學(xué)成分 及酶解效率SED的影響

2.2 預(yù)處時(shí)間對(duì)麥稈化學(xué)成分及酶解率的影響

處理溫度為30℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% NaOH和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% H2O2，分別預(yù)處理0、4、8、12、24、36 h。麥稈化學(xué)成分的變化及酶解情況如圖2所示。

圖2表明在處理時(shí)間小于12 h時(shí)，秸稈化學(xué)成分變化明顯，木質(zhì)素和半纖維素脫除率依次逐漸增大，酶解率也依次增加。當(dāng)處理時(shí)間大于12 h后，變化趨勢(shì)減緩，在24 h之后幾乎就無明顯變化。而酶解效率SED也在處理時(shí)間為24 h達(dá)到93.19%，繼續(xù)增加處理時(shí)間，酶解效率增加不大。綜合酶解率及纖維素?fù)p失等因素，24 h為最佳處理時(shí)間。

2.3 預(yù)處理溫度的探究

取干重原料5.0 g，處理時(shí)間為24 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% NaOH和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% H2O2，分別設(shè)定溫度為20、30、40、50、60℃進(jìn)行預(yù)處理，麥稈化學(xué)成分的變化及酶解情況如圖3所示。

對(duì)照不同溫度處理結(jié)果可知，在處理溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)原料中纖維素和半纖維素的影響較小，對(duì)木質(zhì)素成分影響較大。20～30℃之間樣品中木質(zhì)素含量隨溫度升高降低。當(dāng)處理溫度30℃時(shí)，樣品中木質(zhì)素的含量為16.36%，木質(zhì)素脫除率為48.66%，半纖維素含量為18.81%，半纖維素脫除率為41.81%，樣品中纖維素含量為50.43%，纖維素保留率為89.52%，溫度上升至40℃時(shí)，木質(zhì)素的含量基本不變；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，木質(zhì)素含量反而有所增加，主要是隨著溫度的升高，會(huì)增加過氧化氫的熱不穩(wěn)定性，從而減少木質(zhì)素的脫除。余勇中等[13]提到，在預(yù)處理中加入微量硅酸鎂、硅酸鈉或者沸石做穩(wěn)定劑，可以鈍化秸稈中的 Fe、Cu、Mn離子的活性，從而有效的降低過氧化氫無效分解。樣品SED隨溫度的變化曲線表明，酶解率先隨溫度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，與樣品中木質(zhì)素的含量呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。考慮到增加溫度會(huì)增加能耗，因此預(yù)處理溫度選定在30℃。

圖3 過氧化氫作用溫度對(duì)麥稈化學(xué)成分 及酶解效率SED的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解率的影響

2.4酶解時(shí)間對(duì)酶解效率SED的影響

取處理時(shí)間為24 h、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% NaOH和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% H2O2，在溫度為30℃進(jìn)行預(yù)處理后的濾渣進(jìn)行酶解，分別在4、8、12、16、24、32、48、72 h取樣測(cè)糖含量，并設(shè)置原料直接酶解作為對(duì)照。酶解結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，原料及預(yù)處理樣品的SED均隨酶解時(shí)間的增加而增加，其中預(yù)處理樣品的SED隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速上升，至32 h時(shí)酶解率達(dá)到85.41%，此后酶解率上升減緩，至48 h達(dá)到最大酶解率94.18%；原料的酶解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)處理樣品，72 h時(shí)酶解率僅為19.53%，說明堿性過氧化氫預(yù)處理對(duì)提高纖維素的酶解率是十分有效的。

2.5 表征分析

2.5.1預(yù)處理小麥秸稈SEM表征分析

為了進(jìn)一步研究預(yù)處理后物料化學(xué)成分、酶解效率（SED）與結(jié)構(gòu)特征之間的關(guān)系，采用 SEM 觀察原料和預(yù)預(yù)處理樣品的結(jié)構(gòu)變化。

圖5 小麥秸稈原料及預(yù)處理樣品SEM圖

圖5為小麥秸稈原料（A、B）和堿性過氧化氫預(yù)處理后（a、b）后電鏡掃描圖。從圖5可以看出，未處理的秸稈原料具有比較光滑并且緊密的表面形態(tài)，表面結(jié)構(gòu)基本完整；經(jīng)過堿性過氧化氫預(yù)處理后，秸稈表面形態(tài)與原料完全不同，結(jié)構(gòu)明顯被破壞，表面十分粗糙，出現(xiàn)大量的折皺和孔洞，主要原因是在預(yù)處理過程中原料在堿性條件下充分潤(rùn)脹。原本包裹在纖維素表面的半纖維素和木質(zhì)素被大量脫出，使得纖維素外露，底物的可及性提高，比表面積和孔隙率增大，這種結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于后續(xù)的酶解有積極的影響。

2.5.2預(yù)處理小麥秸稈傅里葉變換紅外光譜分析

預(yù)處理會(huì)改變生物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，采用FT-IR光譜技術(shù)檢測(cè)預(yù)處理后生物質(zhì)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)的變化，結(jié)果如圖6所示。纖維素是由D-葡萄糖單元以β-1,4糖苷鍵構(gòu)成的直鏈高分子聚合物，在 C2、C3、C6上都有一個(gè)自由羥基，其紅外敏感基團(tuán)是 β-葡萄糖苷鍵；半纖維素是由多種單糖組成的復(fù)合聚糖，其紅外敏感基團(tuán)是乙?；土u基；芳香族高分子化合物木質(zhì)素由苯環(huán)經(jīng)過醚鍵和碳碳鍵連接而成，其分子中含有碳氧雙鍵C=O、甲氧基CH3-C=O和芳環(huán)等紅外敏感基團(tuán)[14-15]。經(jīng)過預(yù)處理后，由于其主要成分的變化，會(huì)使紅外圖譜發(fā)生相應(yīng)的改變。

圖6 小麥秸稈原料及預(yù)處理樣品紅外光譜圖

由圖6可以看出，在897 cm-1波段處，樣品中的纖維素 C-H 彎曲振動(dòng)特征吸收峰明顯高于原料，表明經(jīng)堿性過氧化氫預(yù)處理后樣品中的纖維素得到了富集；預(yù)處理后的樣品在1736 cm-1的峰基本消失，在1245 cm-1的吸收峰明顯減弱，表明堿性過氧化氫處理可以斷裂半纖維素和木質(zhì)素之間形成的酯鍵和醚鍵，同時(shí)脫除了大量的半纖維素和木質(zhì)素；代表芳香環(huán)骨架振動(dòng)的1512 cm-1吸收峰消失，表明預(yù)處理脫除了大量的木素。

3 結(jié)論

堿性過氧化氫預(yù)處理可以脫除麥稈原料中的半纖維素和木質(zhì)素，使原料中的纖維素得到富集。在優(yōu)化條件下，即 NaOH 和 H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、處理溫度為30℃、預(yù)處理時(shí)間為24 h時(shí)，所得的樣品中纖維素含量可達(dá)50.43%，纖維素回收率為89.52%，半纖維素和木質(zhì)素的脫除率分別為41.81%和48.66%。將處理后樣品進(jìn)行酶解，其酶解率可提高至94.18%，具有一定的生產(chǎn)價(jià)值。將樣品進(jìn)行掃描電鏡和傅里葉變換紅外光譜分析可知，經(jīng)預(yù)處理后其形貌和官能團(tuán)發(fā)生了很大的變化，這些變化與物料化學(xué)成分的變化及酶解率的提高可以互相印證。