楊 龍, 劉芷含, 張瑞成, 馮 宇, 周延龍, 賈 瀟, 耿德勤, 程言博

小膠質(zhì)細胞(MG)的活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應的主要因素[1]。腦缺血以后,小膠質(zhì)細胞被活化,成為一把“雙刃劍”[2],起損傷和修復雙重效應,因此得到廣泛的關注。程序性壞死(Necroptosis)是一種caspases非依賴的細胞死亡方式,能被受體作用蛋白-1(RIP1)的別構抑制劑Nec-1所抑制[3],Nec-1參與活化的小膠質(zhì)細胞的調(diào)控,能通過影響炎癥信號途徑而發(fā)揮抗炎作用[4,5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Nec-1能使大鼠腦缺血再灌注時,炎癥因子如白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生明顯減少[6]。但Nec-1在減輕缺血再灌注損傷進程中炎癥反應的具體信號通路及其調(diào)控機制尚不清楚。研究表明在MCAO模型中,TLR4、NF-κB和IL-6參與腦缺血再灌注損傷的過程[7,8]。Nec-1減輕腦缺血再灌注損傷后炎癥反應和小膠質(zhì)細胞活化,是否與TLR4/NF-κB途徑以及IL-6有關,目前文獻少有報道。因此,本研究擬通過線栓法制備大鼠MCAO模型,通過檢測小膠質(zhì)細胞標記物iba-1以及TLR4、NF-κB和IL-6蛋白表達情況,探討Nec-1減輕大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應和小膠質(zhì)細胞活化的可能機制,為缺血性腦血管病的治療提供新的靶點和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠96只,清潔級,體重(250±10)g,由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號：蘇SYXK2002-0038。

1.1.2 主要實驗試劑及材料 MCAO栓線(北京沙東生物技術公司),Necrostatin-1(Selleckchem 公司),羊多克隆抗iba-1抗體、小鼠單克隆抗TLR4抗體(Abcam公司),兔多克隆抗IL-6抗體(藥科美生物技術有限公司),兔多克隆抗NF-κB/p65抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 取SD大鼠48只，體重(250±10)g,按隨機數(shù)表法隨機分為Sham組、MCAO組、DMSO組、Nec-1干預組,每組再分兩個亞組,分別為再灌注6 h、24 h,每組6只。Nec-1組于缺血前30 min按640 nmol/kg側腦室注射Nec-1溶液(溶于10%DMSO溶液),DMSO組注射等量DMSO溶液。線栓法制備MCAO模型,于缺血2 h再灌注6 h和24 h,免疫組化染色檢測TLR4、NF-κB/p65和iba-1的免疫陽性細胞表達。

1.2.2 另取48只SD大鼠，隨機分為Sham組、MCAO組、DMSO組、Nec-1干預組,每組再分兩個亞組,每組6只,于缺血2 h、再灌注6 h和24 h,WB檢測TLR4、NF-κB/p65、IL-6蛋白的定位和表達。

1.3 MCAO模型的建立 根據(jù)Longa線栓法制備MCAO模型[9]。將大鼠麻醉后固定,分離右側頸動脈。結扎頸總動脈近心端,遠心端用動脈夾阻斷血流,兩者之間剪一V形小口。將MCAO栓線沿V形口插人頸總動脈,去掉動脈夾,將栓線緩緩推入至右側大腦中動脈起始處,進線深度約18～20 mm。結扎遠心端固定栓線,常規(guī)消毒縫合切口,缺血2 h后拔除栓線行再灌注。

1.4 側腦室給藥參照文獻方法[10]。

1.5 神經(jīng)功能學評分及納入排除標準 (1)根據(jù)Longa方法[9]對腦缺血后2 h的大鼠進行神經(jīng)功能評分。自由活動,沒有神經(jīng)功能障礙者,0分；提起大鼠尾巴左前肢屈曲者,1分；行走時地上打轉,靜止時身體無偏向左側者,2分；行走時地上打轉,靜止時身體也偏向左側者,3分；不能行走,嚴重意識障礙者,4分。(2)納入及排除標準：評分在1～3分的大鼠納入研究。因麻醉原因、手術操作及蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的大鼠死亡和評分低于1分的大鼠予以排除,并隨機選取相同條件大鼠補充。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色 與Sham組相比,MCAO組梗死周圍組織iba-1、TLR4、NF-κB/p65陽性細胞明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與 MCAO組相比,Nec-1組其陽性細胞明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DMSO組與MCAO組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖1、表1、表2)。

2.2 Western blot結果 通過分析灰度值,Sham組梗死周圍組織有少量TLR4、IL-6表達,細胞核內(nèi)有NF-κB/p65表達較低,MCAO組大鼠TLR4、IL-6和核內(nèi)NF-κB/p65的表達顯著增加；與MCAO組相比,Nec-1組TLR4、IL-6的表達量顯著減少,核內(nèi)NF-κB/p65的表達量顯著減少,核轉位減輕,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DMSO組與MCAO組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2、圖3)。

表1 I/R后6 h各組大鼠iba-1、TLR4、NF-κB/p65免疫陽性細胞表達值比較(×10-3/μm2)

與Sham組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

表2 I/R后24 h各組大鼠iba-1、TLR4、NF-κB/p65免疫陽性細胞表達值比較(×10-3/μm2)

與Sham組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

圖1 I/R后 6 h和24 h梗死周圍組織iba-1和TLR4免疫組化染色(Bar=20 μm,×400)

圖2 I/R后 6 h和24 h梗死周圍組織TLR4、IL-6蛋白表達結果

與Sham相比＊P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

圖3 I/R6 h和24 h梗死周圍組織胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白灰度值比較

3 討 論

小膠質(zhì)細胞的活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應的主要因素[1,4,5]。當腦缺血再灌注時,死亡的神經(jīng)細胞會釋放熱休克蛋白-60、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原等內(nèi)源性配體,位與小膠質(zhì)細胞表面的TLR4則能結合這些配體,導致小膠質(zhì)細胞活化[11],活化后會釋放大量炎性介質(zhì),引起繼發(fā)性神經(jīng)元損傷,從而形成惡性循環(huán)造成級聯(lián)放大效應,加重腦組織損傷。腦組織在發(fā)生可逆性缺血事件損傷后,又遭遇了不可逆的二次打擊：小膠質(zhì)細胞的過度活化和炎性因子的大量釋放[12]。

正是由于缺血事件中的二次打擊,尋找一種新的藥物來抑制小膠質(zhì)細胞的活化,減輕炎癥反應顯得尤為重要。抑制caspases活性可以通過靶向作用于小膠質(zhì)細胞來起神經(jīng)保護作用[13],而程序性壞死是caspases非依賴的細胞死亡方式。有證據(jù)表明,體內(nèi)缺失受體相互作用蛋白3,則炎癥反應消失,說明炎癥反應可能源自程序性壞死[14],且前期研究也發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后,給予Nec-1干預,炎性因子產(chǎn)生明顯減少[4,6,15],對腦組織起保護作用,這也對干預程序性壞死途徑抗炎治療提供了可能的依據(jù)。

RIP1是程序性壞死的關鍵激酶,其激酶活性對細胞壞死和凋亡起關鍵作用[16]；而Nec-1通過抑制RIP1激酶活性來保護神經(jīng)組織,可能與減輕下游炎癥反應有關[15],在腦I/R模型中,Nec-1是通過何種途徑減輕炎癥反應和小膠質(zhì)細胞活化來保護神經(jīng)組織,目前尚無確切研究結果。

有研究指出,RIP1是TLR3激活NF-κB信號通路中的基本介導物[17],但RIP1是否在TLR4激活NF-κB通路中起重要作用,目前文獻鮮有報道。因此本研究,通過觀察Nec-1對大鼠I/R后TLR4、NF-κB/p65、IL-6的表達的影響,探討Nec-1在大鼠I/R后小膠質(zhì)細胞活化中的意義,和可能的腦保護機制。

TLR4途徑對小膠質(zhì)細胞活化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應調(diào)控居于核心地位,在腦內(nèi)主要由小膠質(zhì)細胞表達。腦缺血時,TLR4基因敲除的小鼠炎性因子產(chǎn)生明顯減少,腦組織損傷減輕[7]。TLR4 激活后主要通過兩條信號通路產(chǎn)生作用：髓樣分化因子88(MyD88)依賴信號通路和非MyD88依賴信號通路。MyD88依賴信號通路主要作用于NF-κB,其活化后可以促使TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)的分泌,引起免疫炎癥反應[18]。問題是腦I/R時,活化的小膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達是否通過對TLR4、NF-κB的調(diào)控而實現(xiàn)的？

我們前期研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注6 h后小膠質(zhì)細胞開始出現(xiàn)活化,至24 h后活化達到高峰[19]。因此本研究選擇再灌注6 h和24 h兩個時間點。通過免疫組化和WB觀察到假手術組大鼠TLR4和核內(nèi)NF-κB表達極低,手術組表達明顯增高,證明TLR4/NF-κB信號途徑在大鼠缺血性腦損傷中起重要作用。TLR4升高的可能機制為：組織因缺血缺氧壞死產(chǎn)生的大量內(nèi)源性配體如熱休克蛋白60、透明質(zhì)酸等,與TLR4結合,導致小膠質(zhì)細胞活化,后者釋放大量炎性介質(zhì),作用于臨近的小膠質(zhì)細胞,引起中樞神經(jīng)炎癥與膠質(zhì)細胞激活的反饋環(huán),從而放大神經(jīng)毒性分子的產(chǎn)生引起繼發(fā)性神經(jīng)元損害；受損的神經(jīng)元因為這個二次打擊釋放更多的內(nèi)源性配體激活TLR4。Nec-1干預組較手術組表達降低,考慮可能機制有：Nec-1拯救死亡腦組織,使組織程序性壞死減少,小膠質(zhì)細胞表面TLR4內(nèi)源性配體減少；IL-6和TNF-α等促炎性因子表達減少,促炎性因子刺激新生小膠質(zhì)細胞活化減少,使炎癥反應減輕。

此外,本研究還觀察到在缺血2 h,再灌注24 h,Nec-1預處理能明顯改善神經(jīng)功能缺損癥狀,TTC染色顯示腦梗死體積減小,并使腦水腫程度明顯減輕。因此我們可以推斷,在大鼠I/R損傷模型中,Nec-1通過拯救缺血腦組織的程序性壞死,使小膠質(zhì)細胞表面TLR4受體激活減少,至下游經(jīng)典轉錄因子NF-κB核移位減少,從而減輕腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應,對腦組織起保護作用?；罨男∧z質(zhì)細胞通過necroptosis途徑分泌TNF-α、IL-6等因子可能是通過對TLR4、NF-κB的調(diào)控而實現(xiàn)的。

綜上所述,盡管目前已發(fā)現(xiàn)程序性壞死某些調(diào)控炎癥的分子機制,但具體的信號機制尚不明確,TLR4信號通路介導的小膠質(zhì)細胞活化和炎癥因子的釋放是其重要機制之一。動物在體模型中,TLR4、RIP1和NF-κB可能不是簡單的上游與下游的關系,他們可能在促炎癥因子IL-6等的參與下,形成復雜交互的網(wǎng)絡關系,起到相互調(diào)節(jié)的作用,RIP1在炎癥反應中起中樞調(diào)控作用[20]。對TLR4及其信號通路進行干預,可能會為人類治療缺血性腦血管病后炎癥反應提供新的思路。但是,本研究僅局限于動物在體模型中,另外沒有觀察對其他炎性因子和活性物質(zhì)表達的影響,這些均需要進一步深入細致研究。