夏良華， 孫雨晴， 馬雨琴， 顧俊毅， 張 波

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)超聲科，上海 200120)

動(dòng)脈粥樣硬化病變優(yōu)先發(fā)生在動(dòng)脈的分叉和彎曲區(qū)域，造成血流特征性改變，包括剪應(yīng)力降低和湍流增加，提示低剪應(yīng)力是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要因素[1-2]，但其具體作用方式及其影響程度尚不清楚。20世紀(jì)60年代人們提出了兩種關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的剪應(yīng)力病因?qū)W假說，解釋了壁面剪應(yīng)力(wall shear stress, WSS)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響[3-4]。近年來，大量的研究證明低剪應(yīng)力(low shear stree, LSS)促進(jìn)了在體動(dòng)脈腔內(nèi)和血管壁之間低密度脂蛋白的轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞的遷移，泡沫細(xì)胞的形成，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成[5-6]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，持續(xù)降低的WSS可刺激動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、中膜平滑肌細(xì)胞增殖，提示W(wǎng)SS減低是形成動(dòng)脈粥樣硬化的原因之一[7-8]?？赡艿臋C(jī)制是WSS直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells， ECs)表面的機(jī)械感受器，這些機(jī)械感受器依次觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核和基因中，隨后導(dǎo)致促動(dòng)脈粥樣硬化基因表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成[9-11]。本研究擬通過建立LSS動(dòng)物模型探討LSS對(duì)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物模型建立

雄性新西蘭大白兔16只，體質(zhì)量2.2～2.5kg，采購自同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2個(gè)組： 假手術(shù)組(對(duì)照組)及頸動(dòng)脈縮窄組(LSS組)，每組各8只。所有兔均單籠正常喂養(yǎng)，自由飲水，每只兔進(jìn)食普通飼料150g/d。通過左側(cè)頸動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立兔頸動(dòng)脈LSS動(dòng)物模型。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12h禁食，不禁水。耳緣靜脈緩慢推注3%的戊巴比妥鈉30mg/kg全身麻醉，兔取仰臥位，頸過伸，固定于兔臺(tái)上，頸部去毛，以碘伏常規(guī)消毒，手術(shù)在無菌條件下進(jìn)行；采用頸正中切口，顯露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈；以血管夾夾閉其近心端，在暴露的頸總動(dòng)脈近心端動(dòng)脈旁放置一根鈍的8號(hào)注射器針頭(直徑0.8mm)，然后用2-0/T縫合線穿過頸總動(dòng)脈連同針頭一起結(jié)扎；結(jié)扎后抽出針頭，松開血管夾恢復(fù)血流。經(jīng)超聲檢查驗(yàn)證，頸動(dòng)脈直徑狹窄率控制在50%～60%為建模成功。在假手術(shù)組兔中，除最后一步不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，其余操作步驟與LSS組相同。本實(shí)驗(yàn)通過同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，并嚴(yán)格按照倫理要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 兔頸總動(dòng)脈超聲檢查

所有動(dòng)物術(shù)前進(jìn)行超聲檢查1次，術(shù)后每隔2周檢查1次。檢查前12h禁食，不禁水，經(jīng)兔耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉30mg/kg全身麻醉，取仰臥位固定并充分暴露頸部，頸部脫毛處理。選擇Philips iE33超聲診斷儀，使用專用動(dòng)物超聲血管探頭(L15-7io)，探頭頻率為10MHz，對(duì)左右側(cè)頸總動(dòng)脈行二維超聲、彩色多普勒及脈沖頻譜多普勒超聲檢查。分別在左右側(cè)頸動(dòng)脈分叉處下方約2cm處，采集3個(gè)心動(dòng)周期的頸總動(dòng)脈長(zhǎng)軸的二維彩色多普勒血流圖像，并觀察血管內(nèi)情況，測(cè)定左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)徑(inner diameter, D)、內(nèi)中膜厚度(internal-media thickness, IMT)、收縮期峰值流速(peak systolic velocity, PSV)及阻力指數(shù)(resistive index, RI)。

1.3 剪應(yīng)力定量分析軟件測(cè)定兔頸總動(dòng)脈WSS

在頸動(dòng)脈血流中，WSS是單位面積上由血管表面流動(dòng)的液體產(chǎn)生的接近管壁的切向摩擦力。本研究采用WSS定量分析(MATLAB)軟件平臺(tái)[12]，導(dǎo)入動(dòng)態(tài)二維彩色多普勒血流圖像(dicom文件)進(jìn)行分析處理(圖1A)，程序經(jīng)對(duì)兔頸動(dòng)脈彩超圖像的預(yù)處理、配準(zhǔn)和融合(圖1B～圖1D)，自動(dòng)生成頸總動(dòng)脈的WSS數(shù)據(jù)，同時(shí)繪制WSS分布的三維WSS空間圖。如圖2所示，WSS定量分析軟件能在頸總動(dòng)脈內(nèi)同時(shí)獲取約500個(gè)取樣點(diǎn)的WSS值，顯示三維WSS空間分布圖，其中X軸表示沿血管長(zhǎng)軸的橫向位移，Y軸表示垂直于血管長(zhǎng)軸(血管短軸)的縱向位移，Z軸以波幅形式表示W(wǎng)SS的大小。因此，三維WSS空間分布圖能獲得頸總動(dòng)脈WSS分布的可視化效果，也可用以觀察其與血管壁的關(guān)系。該軟件可讀取沿頸總動(dòng)脈前壁與后壁約500個(gè)取樣點(diǎn)WSS數(shù)值，結(jié)果以Excel表格方式保存，并根據(jù)數(shù)值范圍的不同進(jìn)行分類，2～30dyne/cm2平均分為15組，第1組G1： (2,4) dyne/cm2，第2組G2： (4,6) dyne/cm2以此類推，第14組G14： (28,30) dyne/cm2，第15組G15： (30,+∞) dyne/cm2。

圖1 定量分析軟件分析正常組家兔頸動(dòng)脈WSS分布Fig.1 WSS distribution of carotid artery analyzed by WSS quantitative analysis software in normal rabbitsA： WSS定量分析軟件導(dǎo)入正常組家兔頸總動(dòng)脈超聲dicom圖像；B： 提取感興趣區(qū)內(nèi)的彩色多普勒血流圖像；C： 計(jì)算選取區(qū)域內(nèi)的部分頸總動(dòng)脈血管內(nèi)WSS，生成頸總動(dòng)脈長(zhǎng)軸血流剪應(yīng)力二維空間分布圖；D： 生成WSS分布與頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸血管超聲多普勒血流的融合圖像

1.4 病理標(biāo)本的制作

兔死亡或處死后留取左側(cè)頸總動(dòng)脈，用生理鹽水輕輕沖洗后，經(jīng)4%多聚甲醛4℃過夜固定，石蠟包埋、切片(片厚3μm)，二甲苯脫蠟，行蘇木精-伊紅(H-E)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)中膜脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞浸潤、纖維帽及纖維板塊形成情況，根據(jù)鏡下觀察結(jié)果將實(shí)驗(yàn)兔頸動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化程度分為脂質(zhì)條紋期、纖維斑塊期、粥樣斑塊期以及復(fù)合病變期。

圖2 正常組家兔頸動(dòng)脈WSS三維空間分布圖Fig.2 WSS spatial distribution of carotid artery in normal rabbits應(yīng)用WSS定量分析軟件繪制正常組家兔頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸血流剪應(yīng)力三維空間分布圖，X軸表示沿血管長(zhǎng)軸的位移(血管長(zhǎng)度)，Y軸表示沿血管短軸的位移(血管內(nèi)徑)，Z軸以波幅形式表示W(wǎng)SS的大小(單位為dyne/cm2)，圖中箭頭所指為頸動(dòng)脈前壁及后壁

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 超聲檢測(cè)LSS模型兔頸動(dòng)脈參數(shù)變化

術(shù)后所有兔均存活，對(duì)照組兔術(shù)后6周死亡1只，LSS組術(shù)后6、7周各死亡1只，主要死因?yàn)楦腥尽２煌瑫r(shí)間點(diǎn)對(duì)照組及LSS組兔頸動(dòng)脈各項(xiàng)參數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。與術(shù)前比較，對(duì)照組術(shù)后4、8周兔頸動(dòng)脈D、IMT、PSV及RI均無明顯變化(均P>0.05)；與對(duì)照組比較，LSS組術(shù)后4、8周兔頸動(dòng)脈D、PSV及RI均明顯減低(均P<0.05)；與對(duì)照組比較，術(shù)后8周LSS組兔頸動(dòng)脈IMT增加(P<0.05)，提示動(dòng)脈粥樣硬化形成。超聲檢查見LSS組兔頸動(dòng)脈血流呈低阻低排改變，見圖3。

表1 各時(shí)間點(diǎn)兔頸動(dòng)脈超聲檢查測(cè)量參數(shù)

與對(duì)照組相比，#P>0.05；*P<0.05；**P<0.01

圖3 LSS組兔頸動(dòng)脈超聲檢查示血流呈低阻低排改變Fig.3 The ultrasonic images showing low flow rate of carotid artery in LSS groupLSS組家兔術(shù)后4周行左側(cè)頸總動(dòng)脈彩色多普勒模式(CDFI)顯示動(dòng)脈管腔內(nèi)血流充盈情況(A)，脈沖頻譜多普勒模式(PW)顯示頸總動(dòng)脈內(nèi)血流呈低阻低排改變(B)

2.2 LSS模型兔頸動(dòng)脈WSS空間分布改變

如圖4所示，術(shù)后8周對(duì)照組兔頸動(dòng)脈的WSS主要分布在4～10dyne/cm2(83%)，其中，4～6dyne/cm2占35%，6～8dyne/cm2占30%，8～10dyne/cm2占18%(圖4A～4B)；而術(shù)后8周LSS組兔頸動(dòng)脈的WSS主要分布在2～6dyne/cm2(90%)，其中，2～4dyne/cm2占70%，4～6dyne/cm2占20%(圖4D～4E)。百分比堆積柱形圖顯示，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組兔頸動(dòng)脈血流WSS分布范圍在4～10dyne/cm2(占78%)，頸動(dòng)脈血流WSS均值為(6.05±1.19)dyne/cm2(圖4C)；而LSS組兔頸動(dòng)脈血流WSS分布呈現(xiàn)普遍減低，分布范圍在2～6dyne/cm2(占81%)，頸動(dòng)脈血流WSS均值為(2.96±0.79)dyne/cm2(圖4F)。

圖4 正常組及LSS組兔頸動(dòng)脈WSS分布Fig.4 WSS distribution of rabbit carotid arteryA： 正常組兔術(shù)后8周頸動(dòng)脈血流WSS三維空間分布圖；B： WSS數(shù)值分布范圍分析；C： 各時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血流WSS分布；D： LSS組兔術(shù)后8周頸動(dòng)脈血流WSS三維空間分布圖；E： WSS數(shù)值分布范圍分析；F： 及各時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血流WSS分布

2.3 LSS模型兔頸總動(dòng)脈病理檢查結(jié)果

術(shù)后8周取兔頸總動(dòng)脈制成病理切片于顯微鏡下觀察(圖5)。LSS組中兔頸動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的內(nèi)-中膜不規(guī)則增厚、脂質(zhì)沉積增加、泡沫細(xì)胞分布(圖5B)。根據(jù)鏡下觀察進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化病理分期，LSS組中4只兔頸動(dòng)脈處于脂質(zhì)條紋期(66.7%)，纖維斑塊期1只(16.7%)，正常內(nèi)中膜1只(16.7%)；而對(duì)照組的兔頸總動(dòng)脈均為正常。

圖5 正常組及LSS組兔頸動(dòng)脈病理結(jié)果Fig.5 Observation of pathological section of rabbit carotid arteryA： 正常兔頸總動(dòng)脈的病理切片H-E染色結(jié)果(×400)；B： LSS組兔頸總動(dòng)脈的病理切片H-E染色結(jié)果(×400)，可見內(nèi)-中膜不規(guī)則增厚、脂質(zhì)沉積增加、泡沫細(xì)胞分布；LSS組兔頸總動(dòng)脈超聲顯示血流充盈缺損(C)及其病理切片H-E染色結(jié)果(D，×400)，病理切片可見纖維帽及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成(箭頭所指)

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)。雖然動(dòng)脈粥樣硬化形成與傳統(tǒng)的心血管疾病的危險(xiǎn)因素相關(guān)，但其病變優(yōu)先發(fā)生的區(qū)域是在血管分支、分叉和彎曲等血流剪應(yīng)力低或紊亂的區(qū)域[13]。這一部位的選擇性被認(rèn)為與血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)有關(guān)，尤其是WSS[14-15]。血管ECs在體內(nèi)不斷地受到血流剪應(yīng)力的作用,這種血流動(dòng)力環(huán)境對(duì)ECs的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生重要影響。人體內(nèi)大血管的生理范圍剪應(yīng)力為10～20dyne/cm2，血管分叉部位為30～100dyne/cm2，外周動(dòng)脈為20～40dyne/cm2，靜脈為1.5～6dyne/cm2[16]。在不同的剪應(yīng)力作用下,血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)[17]。研究[18]顯示，持續(xù)的層流和生理的WSS可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的橢球形態(tài)，并以時(shí)間相關(guān)的方式對(duì)血流的軸向方向進(jìn)行排列。作為WSS中一種類型，LSS具有促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。LSS刺激可增加氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)低密度脂蛋白在內(nèi)皮下沉積，減少eNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥分子表達(dá)[19]。Walpola等[20]證明LSS通過激活JNK和NF-κB增加炎性細(xì)胞因子表達(dá)。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道LSS容易產(chǎn)生更大的易損斑塊病灶，而紊亂的WSS則產(chǎn)生較小的穩(wěn)定斑塊病灶[21]。在本研究中，通過兔頸動(dòng)脈血管超聲檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后8周LSS組兔頸總動(dòng)脈出現(xiàn)IMT增加(P<0.05)；兔頸總動(dòng)脈病理切片中，LSS組中兔左側(cè)頸總動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的內(nèi)-中膜不規(guī)則增厚、脂質(zhì)沉積增加，甚至出現(xiàn)纖維帽形成及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，而對(duì)照組的兔頸總動(dòng)脈均為正常。由此說明LSS刺激可以促進(jìn)動(dòng)兔頸總動(dòng)脈脈粥樣硬化的形成。

建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)和開展相關(guān)研究的重要環(huán)節(jié)，目前頸動(dòng)脈狹窄模型的制作方法有外科手術(shù)絲線結(jié)扎法，球囊損傷法，干燥空氣損傷法，化學(xué)物質(zhì)燒灼內(nèi)膜法等[22-26]。以上方法或多或少會(huì)造成血管內(nèi)膜或血管壁的損傷，且存在程序多，操作復(fù)雜，不能隨意設(shè)定狹窄度等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)超聲檢查驗(yàn)證，建模成功后頸總動(dòng)脈直徑狹窄率控制為50%～60%，該狹窄程度在減少頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端血流量的同時(shí)不會(huì)出現(xiàn)其他并發(fā)癥。該方法穩(wěn)定可靠，簡(jiǎn)單易行，狹窄血管的長(zhǎng)度和狹窄度可自由設(shè)定和調(diào)控，是一種較好的在體研究WSS變化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響的方法，同時(shí)也是一種快速制作LSS動(dòng)物模型的好方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LSS模型兔頸總動(dòng)脈D、PSV及RI均呈現(xiàn)明顯減低(P<0.05)，超聲檢查見其頸動(dòng)脈血流呈低阻低排改變；LSS模型兔頸總動(dòng)脈血流WSS分布呈現(xiàn)普遍減低，且隨著時(shí)間的增加，低WSS數(shù)值分布比例呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。

綜上所述，本研究通過左側(cè)頸動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立兔頸動(dòng)脈LSS動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)LSS刺激能夠誘導(dǎo)兔頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚及脂質(zhì)沉積，LSS在兔頸動(dòng)脈粥樣硬化的形成中具有重要作用。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅提供了一種新的LSS動(dòng)物模型建立方法，而且為動(dòng)脈粥樣硬化的血流動(dòng)力學(xué)成因理論假說提供了在體試驗(yàn)的依據(jù)。而LSS刺激是如何誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制目前尚不明確，有待于后期進(jìn)一步通過在體及離體實(shí)驗(yàn)來闡述LSS介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。